1
ROZTOKY
1. Činidlo
ˇ A
12,5 g (NH4)6MO7O4 . 4H2O rozpustíme ve 125 ml bidestilované vody;
0,5 g K(SbO)C4H4O6 . 0,5 H2O rozpustíme ve 20 ml bidestilované vody;
Oba tyto roztoky důkladně promícháme a doplníme 4,5M H2SO4 do objemu 500 ml.
Uchováváme v tmavých lahvích při teplotě 4 °C.
ˇ B
50 g L-askorbové kyseliny rozpustíme ve 300 ml bidestilované vody, přidáme 250 ml 4,5M
H2SO4, doplníme bidestilovanou vodou do objemu 1000 ml.
Uchováváme v tmavých lahvích při teplotě 4 °C.
ˇ alkalické
1000 ml A + 20 ml B + 20 ml C smícháme pro vytvoření alkalického činidla.
Roztok A: 60 ml 1M NaOH
50 g Na2CO3 (bezvodý)
doplníme do 1000 ml destilovanou vodou
Roztok B: 0,5 g CuSO4. 5 H2O
100 ml destilované vody
Roztok C: 1 g vinanu sodno-draselného ( C4H4KNaO6.4H2O) rozpustit ve 100 ml destilované
vody.
ˇ Coomassie Brilliant Blue G 250
0,1 g Coomassie Brilliant Blue G250
50 ml etanol (96%)
100 ml kyselina ortofosforečná (85% w/v)
Doplnit do 1000 ml destilovanou vodou
ˇ Folin-Ciocalteu (33%)
167 ml Folinova činidla doplníme do 500 ml destilovanou vodou.
Toto činidlo je nestabilní, je nutné připravit vždy čerstvé a uložit při 4 °C.
ˇ ke stanovení NH4-N
Roztok A: 0,66 g bromkrezolové zeleně a 0,33 g metylčerveně rozpustíme v 1000 ml 95%
etanolu
Roztok B: 40 ml roztoku A přidáme k 400 ml 95% etanolu do odměrné baňky o objemu 2
litry.Potom smícháme 40 g kyseliny borité se 1400 ml teplé destilované vody. Vytvořený
roztok vychladíme a přilijeme do odměrné baňky.Roztok v odměrné baňce alkalizujeme
0,05 M NaOH tak dlouho, dokud se odebraný růžově zbarvený vzorek o objemu1 ml
nezbarví na světle zelený přídavkem 1 ml destilované vody. Takto upravený roztok
doplníme destilovanou vodou do objemu 2000 ml.
2
ˇ ke stanovení redukujících cukrů I
Činidlo A: 16 g bezvodého uhličitanu sodného a 0,9 g kyanidu draselného rozpustíme v 1000
ml destilované vody.
Činidlo B: 0,5 g hexakyanid železito- draselný K3Fe(CN)6 a zředíme v destilované vodě 1000
ml. Uchováváme v tmavé láhvi.
Činidlo C: 1,5 g síran železito-amonný, 1g SDS (sodium dodecyl sulfát) a 4,2 ml
koncentrované kyseliny sírové doplníme teplou destilovanou vodou ( 50°C) do 1000 ml.
ˇ ke stanovení redukujících cukrů II
Roztok I: 15 g vinan sodnodraselný a 30 g Na2CO3 rozpustíme v 300 ml destilované vody.
K vytvořenému roztoku přidáme 20g NaHCO3.
Roztok II: 180 g Na2SO4 rozpustíme v 500 ml destilované vody. Rozpuštěný vzduch
odstraníme z roztoku varem. Roztok necháme vychladnout při pokojové teplotě.
Roztok III: roztok I a roztok II smícháme a doplníme do 1000 ml destilovanou vodou.
Roztok IV: 5 g CuSO4 . 5H2O a 45 g Na2SO4 rozpustíme v 250 ml destilované vody.
Roztok V: jeden díl roztoku III a 1 díl roztoku IV.(připravuje se těsně před použitím!)
2. DMA (defined medium anorganic)
0,875 g K2HPO4
0,475 g NaH2PO4
0,2 g MgSO4 .7H2O
0,01 g CaCl2
2,0 g NH4Cl
1000 ml vodovodní vody;
Sterilizace 150 kPa 20 minut.
3. Extraktant TCA-fosfát-paraquant
Roztok A: 81,6 g TCA (trichloroctová kyselina)
89,6 g Na2HPO4.12 H2O
600 ml destilovaná voda
Roztok B: 25,8 g paraquant (1,1-dimetyl-4,4bipyridylium chlorid)
100 ml destilovaná voda
smíchat roztok A (600 ml) a B (100 ml)
4. Fyziologický roztok
8,5 g NaCl
1000 ml destilované vody
Upravit pH na 4,25
5. Kaseinát sodný (2%)
10 g kaseinátu sodného přidáme do teplé destilované vody (50 °C). Umístíme na magnetickou
míchačku a doplníme destilovanou vodou na objem 500 ml.
Jestliže máme k dispozici pouze kasein, rozpustíme 10 g kaseinu v Tris-HCl pufru, upravíme
hodnotu pH na 8,1 přídavkem NaOH a doplníme do 500 ml 0,05M Tris-HCl pufrem
(pH=8,1).
3
6. (KM) kultivační médium
20 g Pepton
3 g Beef extract
1000 mldestilované vody
Sterilizace při 200 kPa 20 minut.
7. LB-agar
10 g Trypton
5 g Yeast extract
5 g NaCl
20 g agar-agar
rozpustit v 1000 ml destilované vody, před přidáním agaru upravit pH na 7,3
Sterilizace při 250 kPa po dobu 20 minut.
8. LB-médium
10 g Trypton
5 g Yeast extract
5 g NaCl
rozpustit v 1000 ml destilované vody, upravit pH pomocí 1M NaOH na 7,3
Sterilizace při 250 kPa po dobu 20 minut.
9. M9 (minimální médium)
7 g Na2HPO4.2H2O
3 g KH2PO4
1 g NH4Cl
0,5 g NaCl
4 g glukóza
0,25 g MgSO4.7H2O
0,02 g CaCl2.2H2O
do 1000 ml doplnit demineralizovanou vodou
10. MEA (malt extract agar)
Připravit MEB
20 g agar-agar
Sterilizace při 120 kPa po dobu10 minut.
11. MEB (malt extract broth)
17 g Malt extract
3 g Pepton
1000 ml destilované vody
Upravit pH na 5,4
Sterilizace při 120 kPa 10 minut.
12. Močovina (0,2 M )
1,2 g močoviny rozpustíme přibližně v 80 ml 0,05M Tris-HCl pufru (pH=9,0), doplníme tímž
pufrem do objemu 100 ml. Roztok připravujeme vždy čerstvý a uchováváme během dne při
teplotě +4°C.
4
13. MPA1 (masopeptonový agar č. 1)
5 g NaCl
3 g Beef extract
5 g Pepton
20 g agar-agar
1000 ml destilované vody
Sterilizace při 200 kPa 20 minut.
14. MPB1 (masopeptonový bujon č.1)
5 g NaCl
3 g Beef extract
5 g Pepton
1000 ml destilované vody
Upravit pH na 7,2
Sterilizace při 200 kPa 20 minut.
15. MPB konc. (masopeptonový bujón koncentrovaný)
3 g Beef extract
10 g Pepton
100 ml destilované vody
Upravit pH na 7,2
Sterilizace při 200 kPa 20 minut.
16. Oxaloctová kyselina
2 mg kyseliny oxaloctové do 1 ml 0,1M fosfátového pufru (pH = 7,5)
17. Pufr
ˇ acetátový ( 2M,pH 5,5)
164,8g octanu sodného (bezvodý)) rozpustíme ve 700 ml destilované vody. Zředěnou
kyselinou octovou upravíme hodnotu pH na 5,5 a doplníme objem na 1000 ml.
5
ˇ acetátový (0,1M,pH 5,5)
13,6g octanu sodného (tetrahydrát)) rozpustíme ve 700 ml destilované vody. Zředěnou
kyselinou octovou upravíme hodnotu pH na 5,5 .Poté přidáme 2 g azidu sodného a doplníme
objem na 1000 ml.
Kys. Octová (ml) Octan (ml) pH
46,3 3,7 3,6
44 6 3,8
41 9 4
36,8 13,2 4,2
30,5 19,5 4,4
25,5 24,5 4,6
20 30 4,8
14,8 35,2 5
10,5 39,5 5,2
8,8 41,2 5,4
4,8 45,2 5,6
Pozn.: Pufr sestává z roztoku 0,2M kys. octové a 0,2M octanu sodného. 0,1M pufr připravíme
smícháním uvedeného množství složek a doplníme do 100 ml vodou.
ˇ borátový (pH=10)
56,85 g tetraborátu dvojsodného nebo 30 g tetraborátu dvojsodného (bezvodý) v 1500 ml
teplé destilované vody. Po ochlazení upravíme hodnotu pH na 10 pomocí 20% NaOH a
doplníme na objem 2000 ml destilovanou vodou.
ˇ citrátový
42 g kyselina citronová
16 g NaOH
900 ml destilované vody
Upravit na pH = 5,0 přídavkem 10M NaOH
ˇ EDTA-magnesium arzenátový
Roztok A: 31,2 g Na2HAsO4.7H2O v 800 ml destilované vody
10 ml 0,2 M EDTA (tetra sodium)
Roztok B: 2,46 g MgSO4. 7H2O
100 ml destilovaná voda
(pH upravit 1M H2SO4 na hodnotu 7,4)
smíchat roztoky A (800 ml) a B (100 ml) a doplnit na objem 1000 ml destilovanou vodou
6
ˇ fosfátový 0,067M
0,067M KH2PO4 (ml) 0,067 M Na2HPO4 (ml) pH
9 1 5,91
8 2 6,24
7 3 6,47
6 4 6,64
5 5 6,81
4 6 6,98
3 7 7,17
2 8 7,38
1 9 7,73
0,5 9,5 8,04
Pozn.: 0,067 M roztok KH2PO4 připravíme rozpuštěním 9,078 g soli v 1000 ml redestil. vody.
0,067 M roztok Na2HPO4.2H2O připravíme rozpuštěním 11,876 g soli v 1000 ml redestil. vody.
Sterilizace při 200 kPa 20 minut.
ˇ fosfátový 0,1 M (pH = 7,5)
13,61 g KH2PO4
22,82 g K2HPO4.3H2O
1000 ml destilované vody
ˇ fosfátový 0,05 M (pH 7,2)
1,431 g Na2HPO4. 12 H2O
0,549 g KH2PO4
rozpustit v 240 ml destilované vody
ˇ fosfátový 0,05M (pH= 8,0)
50 ml 0,2 M KH2PO4
46,85 ml 0,2 M NaOH
doplnit destilovanou vodou na 200 ml
7
ˇ Tris-HCl (0,05M)
0,05M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) pufr dle Gomoriho
HCl (ml) pH
44,2 7,2
41,4 7,4
38,4 7,6
32,5 7,8
26,8 8
21,9 8,2
16,5 8,4
12,2 8,6
8,1 8,8
5 9
Pozn.: K 50 ml 0,2M roztoku TRIS přidáme uvedené množství 0,2M HCl
a doplníme dest.vodou na 200 ml.
0,2M roztok TRIS připravíme rozpuštěním 24,2 g TRIS v 1000 ml destil. vody.
18. Roztok
ˇ arzenát-molybdenát
25 g molybdenanu amonného rozpustíme ve 450 ml destilované vody. Přidáme po kapkách
( za neustálého míchání) 25 ml koncentrované kyseliny sírové. Na závěr přidáme 25 ml
Na2HAsO4.7H2O ( 3 g .25 ml-1
vody) a důkladně promícháme. Připravený roztok ponecháme
2 dny při 37°C v termostatu a přelijeme do tmavé láhve. Těsně před použití smícháme 1 díl
tohoto roztoku se dvěma díly 0,75 M H2SO4.
ˇ dichloroizokyanid sodný (0,1%)
0,1 g dichloroizokyanidu rozpustíme ve 100 ml destilované vody (připravit těsně před
použitím)
ˇ KCl
74,6 g KCl rozpustíme v destilované vodě a přidáme 10 ml 1 M HCl (32% HCl odpovídá
10M HCl). Doplníme destilovanou vodou na 1000 ml.
ˇ ke stanovení ureázy [ 2,5M KCl + síran stříbrný (100 mg.l-1
)]
100 mg Ag2SO4 v 700 ml destilované vody. Ve vytvořeném roztoku rozpustíme 188 g KCl a
doplníme do 1000 ml destilovanou vodou.
8
ˇ KMC (roztok karboxymetyl celulózy)
Příprava 0,7%(w/v) roztoku:7 g KMC (sodná sůl) rozpustíme v 1000 ml acetátového pufru a
mícháme při teplotě 45°C po dobu 2 h. Vzniklý roztok musí být uchováván v chladu při
+4°C, nejdéle po dobu jednoho týdne.
ˇ NaHCO3
42 g NaHCO3 rozpustíme v 900 ml destilované vody a upravíme pH na hodnotu 8,5 pomocí
10M NaOH. Doplníme do 1000 ml destilovanou vodou.
ˇ salicylátu sodného
17 g salicylátu sodného rozpustíme v destilované vodě. Přidáme 120 mg nitroprussid sodný a
doplníme destilovanou vodou do 100 ml.
ˇ stimulační
39 mg Yeast extract
58,5 mg NH4Cl
15,6 mg MgSO4 . 7H2O
13 mg KH2PO4
rozpustit a doplnit na objem 160 ml destilovanou vodou
19. Standard
ˇ ATP (10-3
M)
6,23 mg ATP (disodium)
7,0 ml pufr EDTA-magnesium arzenátový
ˇ ke stanovení ninhydrin-reaktivního dusíku
10mM L-leucin (1,312 g/l)
10mM NH4-N (0.661 g (NH4)2SO4 /l)
Roztoky jsou připraveny odděleně v 0,5M K2SO4 a ředěny v rozsahu 0-1000  NH4-N
ˇ NH4-N (50g NH4-N ml-1
)
0,234 g síranu amonného rozpustíme v 1000 ml destilované vody.
ˇ NH4-N ( I + II)
Roztok I :
3,82 g chloridu amonného rozpustíme v destilované vodě a doplníme v destilovanou vodou na
objem 1000 ml ( 1000 mg NH4-N ml ­1
). Roztok je stabilní po dobu několika týdnů při teplotě
+4°C.
Roztok II:
Pipetujeme 0,0, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 ml roztoku I do odměrných baněk (100 ml) a doplníme do
100 ml roztokem KCl.
ˇ tyrozin
50 mg tyrozinu rozpustíme ve 100 ml 0,05M Tris-HCl pufru (pH=8,1).
9
20. TA (tryptonový agar ­ 2%;0,7%)
10 g Trypton
4 g Yeast extract
3 g NaCl
20 g agar-agar (pro přípravu 0,7% TA navážíme 7 g agar-agar)
Doplnit destilovanou vodou do 1000 ml
Sterilizace 150 kPa 20 minut.
21. TB (tryptonový bujón)
10 g Trypton
4 g Yeast extract
3 g NaCl
Doplnit destilovanou vodou do 1000 ml
Sterilizace 150 kPa 20 minut.
22. Trichloroctová kyselina (15%)
75 g trichloroctové kyseliny (TCA) rozpustíme přibližně v 300 ml destilované vody a
doplníme destilovanou vodou do 500 ml.
23. Tween 80
1% emulze polyoxyetylensorbitan monooleátu v 0,05M Tris-HCl pufru
Homogenizujeme roztřepáním do vytvoření stabilní emulze
24. YE konc. (yeast extract koncentrovaný)
2 g Yeast extract
100 ml destilované vody
Upravit pH na 7,2
Sterilizace 150 kPa 20 minut.