Přednáška 29.11.2005 RNDr. Alena Vaculová, Ph.D
i»ía.rv»hôim üri» mčn, mno
APOPTÓZA - Droaramovaná buněčná smrt:
- bobtnání cytoplazmatické membrány
- kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu
- tvorba „apoptotických bodies"
- účast specifických molekul - kaspázy, nekaspázové proteázy, endonukleázy, ATP
- nevyvolává zánětlivé reakce
miitínifruJ dmcicr (mral
ruckvi
Necrosis
Apoptosis
/
%
HTTP
a
b
c
d
proliferace
apoptóza        q ~Q
Rakovina AIO
homeostáza
AIDS
neurodegenerativní
onemocnění
seen ding-
colon
Transverse coíon
Descending colon
Tlusté střevo
+ HT-29
y<:*j
iß
m
■*•:•
	lU	-ť	V	f	-	F /j *		^.'
y *				' **				9fj
t
iQJlĽ
Ste
This low magnification view of the colon shows:
1) the lumen (Lu), containing fecal matter (Fe);
2) the mucosa (Mu), containing crypts of Lieberkuhn (Cr);
3) the submucosa (Su) containing lymphoid cells (LC);
4) the muscularis externa (ME) consisting of an inner layer (IL) and an outer layer (OL) of smooth muscle
5) the serosa (Se), consisting of a single layer of mesothelial cells, which covers the outer surface of the colon. The folding of the submucosa is normal for an empty colon.
Stain = H&E
DIFFERENTIATION
PROLIFERATION
§J
^
m
Fufly differentiated terminal «lis
Pral i f* rati ng /dtfferenti ating ceSls
Stem cells
REPLICATION STAGES
Rakovina tlustého střeva
Nerovnováha mezi buněčnou proliferací, diferenciací a apoptozou -porušení homeostazy tkáně - podmínky pro rozvoj nádorového onemocnění - kolorektální karcinom
vyvíjí se pomalu - nejprve benigní polypy - pak akumulace mutací (díky vysoké míře proliferace) a maligní zvrat
počáteční stádia - dobře léčitelná (chirurgie, v raných fázích jedno z nejlépe léčitelných nádorových onemocnění)
polovina nádorů CRC však zjištěna až v pokročilém stádiu (nedostatečný screening)
vysoká incidence CRC v ČR - přední místo ve statistikách, neustálý alarmující nárůst
možnost vvznamně ovlivnit vvvoi onemocnění složením vvžhr
obrovský význam prevence!
Ovlivnění procesů oroliferace, diferenciace a
Exogénni faktory - látky přijímané v potravě -lipidove složky výživy (PUFAs)
Endogenní faktory - členové proteinové rodiny TNF (TNF-oc, FasL, TRAIL)
Možné interakce ve střevě?
Vvznam těchto interakcí?
TNF-g, FasL, TRAIL
-členové rodiny TNF
-úloha v imunitních a zánětlivých reakcích organismu, v regulace proliferace, diferenciace a apoptózy
-podobnost apoptotických signálních drah (oligomerizace receptoru, adapterovy protein, death doména, iniciační kaspáza)
- vazba na tzv „death receptory" (TNFR1, Fas, TRAIL-R1,TRAIL-R2)
■ <tl>orcitoi yfcokinetikv
nioFysíholni ůiln« flVČIV BRNO
TRAIL-R
DISC - death inducing signaling complex
FLIP Pro-caspase-8
Initiator caspases
Cell membrane
1
UFADD
Bid
Caspase-8,
t
mitochondria
tBid
Bcl-2 n^          Cytochromec
O
d ATP'
• []    Apaf-1
Ů
°0 l=l Dl__U
Caspases        Pro-Caspase-9
Effector caspases
Caspase-6
i
Death
I        I Caspase-3
substrates
TNF-oc. FasL. TRAIL
MM'M E
- využití   v
alternativa   ke   konvenčním   léčebným   postupům využívajícím chemoterapii a ionizující záření
- omezení: - vedlejší účinky, rezistence
- hledání látek schopných zcitlivět nádorové buňky k účinkům TNF-oc a Fas - kombinovaná terapie
-možný kandidát - PUFAs
■ <tl>orcitoi yfcokinetikv
nioFysíholni ůiln« flVČIV BRNO
Vvsoce nenasvcené mastné kvselin
* mastné kyseliny obsahující 2 a více dvojných vazeb
* důležité složky lipidů přijímaných v potravě
* kvantitativní a kvalitativní zastoupení PUFA v potravě může hrát důležitou úlohu v etiologii některých nádorů (např. tlustého střeva a prsu)
•ovlivnění orocesů buněčné d rol if e race a aooDtóz
■ ciborcit«
Vtehinstiky
HioFVsí kôlni üsfeciv nv£flr An H O
n-3 vs. n-6 PUFAs
Dvojná vazba
?
C—OH
Zdroie PUFA v dietě
n-3 - rostlinné oleje (lněný, řepkový, sojový), rybí tuky, fytoplankton
n-6 - rostlinné oleje (slunečnicový, pupalkový, kukuřičný), živočišné tuky
- tzv. esenciální mastné kyseliny EFAs
ct.-Linolen i c acid. 18:3/1-3
A6
(planta)
18:4/1-3
plongase
T 20:4/i-3
A5
3 series PGs     c O and TXs      X.
f eicosapentaenoic acid
Xn        20:5n-3
5 series LTs
lelongase
22:5/i-
I
A4
docosahexaenoi acid
■
linoleíc acid _,
~~   18:2n-6    "*"
A6
■y-linolenic acid 3 8:3/i-6
e Ion gase
dihomo 7-linolenic ací 20:3/i-6
*l
A4
I
I
[t
22:571-6
A12 (planu)
stearic acid 18:0
A9
oleic acid 18:lrt-9
Further de saturation and elongation
1 series PGs  pnd TXs series LTs
2 series PGs and TXs
4 series LTs, LXs, 12 and 15 HETEs and HPETEs
1
PGG/H synthase
+20, PG(|
Nádory střeva!
arachidonic acid
COOH
5-
12-LOX]
15-
+QZ
cyt P450 epoxygenasesl
+1/2 02 +NADPH
5-
12-HPETE
^5-,
epoxy acids diols
5-12 15
LTA
HETE      ^ LTB.
LTC
4  4
LTD/i
4  4
lipoxins iTc  -1
k- peptidoLTs
PUFAs v dietě
důležitost kvalitativního a kvantitativního zastoupení
- Epidemiologické studie (Eskymáci, Japonci, západní populace)
- Experimenty in vivo (myši, chemicky indukované nádory střeva a vliv PUFAs)
- In vitro studie - buněčné a tkáňové kultury - možné mechanismy....
- cíl experimentů - prokázat a objasnit působení PUFAs z potravy na proliferaci a smrt jak normálních, tak nádorových buněk (využití poznatků v prevenci a léčbě rakoviny tlustého střeva)
secretion
membrane fluidity
\
PUFAs
membrane phospholipids
lextracellular signal
Mechanismy působení
n-3 PUFAs v buňce
-Inhibice aktivity enzymů
- COX-2 (funkce: CRC - PGE2 - posílení proliferace, blokace apoptózy, posílení invazivity a angiogeneze)
- PLA2, PLC
- PKC (zvýšená aktivita u CRC)
- ilMOS (nádorová promoce, zvyšuje expresi COX-2, ovlivnění aktivity kaspáz, množství p53 atd)
- enzymy zodpovědné za transformaci primárních žlučových kyselin na sekundární (genotoxicke působení)
Ovlivnění metastatického potenciálu buňky a angiogeneze
Experimentální
cast
Studium proliferace a apoptózy nádorových buněk
tlustého střeva (linie HT-29) po působení PUFAs a
cvtokinů TNF rodin1
Vaculová A., Hofmanová J., Souček K., Kovaříková M., Kozubík A.: Tumour necrosis factor-a induces apoptosis associated with poly(ADP-ribose) polymerase cleavage in HT-29 colon cancer cells. Anticancer Research 22: 1635-1640, 2002
Vaculová A., Hofmanová J., Souček K., Anděra L., Kozubík A.: Ethanol functions as a potent agent sensitizing the colon cancer cells to the TRAIL-induced apoptosis, FEBS Letters, 577, 309-313, 2004
Hofmanová J., Vaculová A., Kozubík A.: Polyunsaturated fatty acids sensitize human colon adenocarcinoma cells to the death ligand-mediated apoptosis. Cancer Letters 218, 33-41, 2005.
Vaculová   A.,   Hofmanová   J.,   Anděra   L.,   Kozubík   A.:   TRAIL docosahexaenoic acid cooperate to induce HT-29 colon cancer cell death. Cancer Letters,229, 43-48, 2005.
Cíle oráče - otázkv:
Je možné modulovat účinky endogenních
EOT
prostřednictvím PUF As (AA a DHA) u buněk lidského adenokarcinomu kolonu HT-
Které mechanismy se uplatňují?
secretion
PUFAs
membrane fluidity
\
PUFAs
lextracellular signal
Prokázali jsme, že po inkubaci buněk HT-29 s PUFAs (AA, DHA) dochází k:
- zvýšené inkorporaci těchto kyselin do buněčných membrán
- zvýšení produkce reaktivních metabolitů kyslíku
- posílení lipidové peroxidace
- změnám buněčného cyklu
(Hofmanová J., Vaculová A., Lojek A., Kozubik A.: Interaction of polyunsaturated fatty acids and sodium butyrate during apoptosis in HT-29 human colon adenocarcinoma cells. European Journal of Nutrition 10, 1-12, 2004)
cibcrcit
Vlokinelikv
nioFq>» kôlni win« fiv£nr HNO
Inkoroorace PUF/
*^^^^^
SzZzHzz ffrfffff-
i        phosphate group
Phospholipids
i
CH2
i O
0=P-0
I
o
CH2-CH-CH2 Ô  Ô C=0 C=0
CH2 CH2
i   i
CH2 CH2
i   i
CH2 CH
CH2-N(CH2)3
Polar region
i
CH2
i CH2
i
CH2 CH2 CH3
CH
\
CH2 CH2 CH2 CH3
Typy fosfolipidú (PS, PCh, PE, PI)
Ovlivnění signálních drah, vlastností membrány
Naše experimenty
Lioidová Deroxidace ÍLP
- oxidace PUFAs
- katalytická řetězová reakce iniciovaná a propagovaná pomocí volných radikálů
- fáze (iniciace, propagace a terminace)
- citlivé substráty lipidové peroxidace - mastné kyseliny se 2 a více dvojnými vazbami (více dvojných vazeb - více citlivé k oxidativnímu poškození)
- vysoká akumulace těchto PUFAs činí buňky velmi citlivé k peroxidaci, oxidativnímu poškození
- produkty LP: - primární (hydroperoxidy) a sekundární (aldehydy)
-Vysoce cytotoxické, ovlivňují řadu procesů v buňce
- MDA - malondialdehyd
-Měření produkce MDA - TBA assay (TBA reaguje s MDA za vzniku růžového komplexu, kolorimetrický test; více MDA, inzenzívnější peroxidace)
I
Oxidative Burst
Cellular Respiration
*    SOD
t
Environmental Factors

HoO
H20+ 02
Gftc
Protein Peroxidation
HoO
GRed
Lipid Peroxidation
DNA Damage
by G.P, Eckert
www. b iozentru m. uni-f ran kfu rt.d e/Pha rma kolog ie/i ndex .html
- 2nd messengers vs. oxidatívni poškození - rozlišovat!!!!
Měření produkce reaktivních kyslíkových
metabolitů ÍROS) - průtokový cvtometr
- Peroxid vodíku
- dihydrorhodamin-123 (DHR-123)
- dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA)
-Superoxid
- hydroethidin (HE)
HaN-1	I	o		1	^NHj	HRP	i]		
	H     I			^n-       ^bJ*^	^^m		^^■O1,  ^^^	1   ^^	
				r*"-^^		H^			
			^	1 1	~^^^ 1            1     H				
		1		o				\jfit	0
	c		í					(nj	
+ naše experimenty
Oxidative Burs
Měření fluorescence
Modulace buněčného cvklu a oroliferace prostřednictvím PUFAs
- významné ovlivnění proliferace nádorových buněk pomocí mastných kyselin
- silná závislost na typu PUFA, její koncentraci a době působení
- paradox mastných kyselin (Cornwell, Morisaki, 1988)
- nízké koncentrace - stimulace proliferace
- vysoké koncentrace - inhibice proliferace
Studium proliferace buněk po působení PUFAs v našich experimentech:
- stanovení počtu buněk (přisedlé, plovoucí, celkem), viability
- inkorporace 3H thymidinu
- mereni bunečného Cyklu (po obarvení DNA - propidium jodidem)
- studium proteinů zapojených v regulaci buněčného cyklu
Vazba PI na DNA -množství PI je úměrné množství DNA
+ subdiploidní populace

Purdue University Cytometry Laboratories
AA, DHA (10-50 uM - 48h působení - buněčná linie HT-29:
-v uvedených koncentracích a době působení neindukovaly PUFAs apoptózu u studované buněčné linie
-ale významné změny :
- oxidatívni metabolismus buňky
- buněčný cyklus
- buněčná adheze
- inkorporace PUFAs do membrán
možné ovlivnění apoptotických signálních drah (indukce apoptózy přes tzv. death receptory)
Otázky:
Jsou PUFAs schopné modulovat apoptotické signální dráhy TNF-oc, FasL a TRAILu?
Pokud ano, jaké mechanismy se uplatňují a na jaké úrovni signální dráhy dochází k interferenci?
Na otázky odpoví následující experimenty:
AAaDHA
vs.
TNF-a a anti-Fas
There are molecules on the surface of the cell which match its neighbours
Basement membrane
r\ ŕ\
ícadľiGrFrtat
dfismraom« iuiiuhu'sna-"
gap junction-
infegrine :
hernjdeímosoma       focaJ cc ntact          i ntegrai
Hntegrinsl                imtegrira)         membrána
proteoglycan     irtegriris
JUNCTIONAL ADHESION IWECHANlSM*
._J     '     —--
NONJUNCTIONAL ADHESION MECHANISMS
http://ntri.tamuk.edu/homepage-ntri/lectures/protein/adhesion.gif
+ subdiploidni noDulace
90
80
70
£   60
8   50
^   40
30
20
10
floating cells subG0/G1 population
DHA(iLiM) TNF (ng/ml)    " anti-Fas (ng/ml) -CHX(|Lig/ml)    .
20
20
20
30  30
20
20  -  20
30  30
200 200
200 200
5   5  5   5  5   5
o
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
AA (|LiM) TNF (ng/ml)    ■ anti-Fas (ng/ml). CHX (|Lig/ml)
floating cells subG0/G1 population
50
50
50
30     30
50
50
50
30     30
200   200
200   200
Hodnocení jaderné morfoloaie buněk
Barvení DNA - DAPI, pak hodnocení - fluorescenční mikroskop - charakteristická apoptoticka morfologie jádra - kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu)
-v .-.

30
25 20
15
10
+x
+x
D
řiil li
/ ^v*<v>vv
^
<y'
&
r
&
&
á»
CD
oo
CD ■jZ-
CO
O CD CO
■jZ- -J
Control DHA TNF DHA-TNF
^r—■---------1--------1—i—i i i 11 i
n 10u                       10
-i--------1—i—r-r
T-------1------1—i—i i 11  |
-i--------1—i—i  i  i 111
10L
10-
10
DHR-123(FL1-H)
CD					
CD — CO    -B   : CD    -T -ÜD    -CD    -CO -*A T    -^--3 O CD    ■ ^> OJ -CO    -CD    -ÜD -■—■		l_	hf '             Control / Ij/L    ___   DHA \           Anti-Fas \   ifvÁ----   DHA-Anti-Fas	I	
			jj Nl§^	I	
10°      '     '		■   iiiiii 101	i         i—i—i-i-i-i-ry-          ■         i—i—i-i-i-i-i-f—          i         i—i—r 10^                          10J DHR-123(FL1-HJ	■ '" r 10	*
floating cells (%) -^  ho co  -^  en  o>
O/
A
^
%
A
%
?,
%,
c	cell viability (%) -^roco-^cno^icocoč DOOOOOOOOOC										D D
\ V v										1	
	1										
									H		
	H										
											
											
						p +	*				
											
											
											
Viabilita
Obarvení buněk eosinem
Test integrity plazmatické membrány
(obarví se mrtvé buňky s porušenou integritou plazmatické membrány, živé zůstanou beze změn)
mean of fluorescence
■^   -^   N)   K)   W  W   ^ 010010010010
<v
D
\

A
\
'«,

H   *
TRAIL-R
Cell membrane
FLIP
Pro-caspase-8
Initiator caspases
UFADD
tBid
\
I   Bid  I
Bcl-2
O
Cytochromec
Caspase-8,
t
d ATP'
Ů  *
• []    Apaf-1
°0 l=l
Dl____U
Caspase-9        Pro-Caspase-9
Effector caspases	Caspase-6 i	ii	
		Caspase-3	
		▼	
	|               Death	substrates      \	
Kaspáz'
- Cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové
- Klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu
- v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy), štěpení -aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty"
- struktura:
- Prodomena
- Katalytické podjednotky - velká a malá (heterotetramer)
-dělení:
- Iniciační kaspázy (dlouhá prodomena) - kaspázy-8, -9
- Efektorové (krátká prodomena) - kaspáza-3
Inactive Proenzyme
Q Frodomain J^    Large
subunits
Í
Small )
Aap X
Catalytic Sites
Active Caspase
Pro-caspase-8
Pro-caspase-3 Bid
PARP Beta-actin
/
g
PolvŕADP-ribosvh polymerase (PARP
Jaderný protein (113 kDa), opravy DNA
Během apoptózy specificky štěpený na fragmenty 89 a 24 kDa
-  citlivý marker pro detekci apoptózy
Inaktivace PARP blokuje opravu DNA, posílení fragmentace DNA
ytokmetics
DNA strand nicks
massive DNA disruption
repair i
PARP activation
NAD+   Poly(ADP-   ' ribosyl)ation
PARP OVERACTIVATION
NAD+     Poly(ADP-ff              ribosyl)ation
4 ATP
Energy metabolism
Energy failure
CELL DEATH
Mitochondrie
centra buněčného dýchání, energetická centra buňky
složení:
vnější membrána - semipermeabilní (5 kDa), kanálky (porin)
vnitřní membrána - nepropustná, pouze selektivní transport, bohatě členěná (kristy - zvětšení povrchu - syntéza ATP), zde ukotveny proteiny - součásti elekron-transportního řetězce, transport elektronů a syntéza ATP
intermembranovv prostor (enzymy, proapoptotické proteiny)
matrix - vysoce koncentrovaná směs enzymů, DNA, ribozomy, citrátový cyklus
uter mitochondrial nem brané
Inner mitochondrial membrane
Inte rmemb rane
space
Matrix
© 2003 Thomson - Wadsworth
Electron transport leads to proton pumping across the inner mitochondrial membrane
MMP normální buňka vs. apoptotická
Úloha mitochondrií v aoootóze
- Změny v transportu elektronů
- Změny energetického metabolismu buňky
- Změny v produkci ROS
- Změny mitochondriálního membránového potenciálu
- Účast proteinů rodiny Bcl-2 (Bid, Bak, Bax...) -Uvolnění proapoptotických proteinů
Měření mitochondriálního membránového potenciálu
Flowcytometr - po obarvení TMRE
Hodnocení % buněk se sníženým MMP
Q.
Q) (ft CO
Ö Q)
Q) O
70 60 50 40 30
S   20
(O
10 0
+x								
							T	
								
* T                 I								
T								
								
	-i—							
-\-------------								
								
control
DHA
TRAIL      TRAIL+DHA
ZÁVERY:
PUFAs (AA a DHA) mohou významně posilovat apoptózu buněk HT-29 indukovanou
TNF-oc, FasL a TRAILem u lidských nádorových buněk tlustého střeva
■ <tl>orcitoi yfcokinetikv
nioFysíholni ůiln« n«ČRr BRNO
Důsledkv a aplikace:
Zásadní význam diety v prevenci/rozvoji nádorového onemocnění střeva, především obsahu PUFAs v lipidech přijímaných v potravě
Možné využití PUFAs v proti nádorové terapii (významná modulace účinků některých protinádorových terapeutik)