Mikrobiální antigen, protilátka proti němu a jejich využití v diagnostice pro studenty PřF hlavně pro obor Obecná biologie Ondřej Zahradníček Dnes máme na programu n Krátký přehled interakcí makroorganismus – mikrob n Stručný přehled imunologie s důrazem na postavení antigenu a protilátky v.imunitním systému n Význam antigenu a protilátky pro člověka, průběh protilátkové odpovědi n Využití existence interakce antigen – protilátka v praktické mikrobiologické diagnostice (první část) `a praktika Interakce mikrob – makoorganismus: obecně I n Mezi jakýmikoli dvěma komunikujícími organismy mohou existovat interakce: mikrob – mikrob, makroogranismus – makroorganismus. n Nás v tuto chvíli zajímá intergakce mezi mikrobem (mikroorganismem) a hostitelským organismem (člověk, ale i zvíře, rostlina, jiný mikrob…), která má jistá specifika Interakce mikrob – makoorganismus: obecně II n Může to být n kooperace (člověk poskytuje útočiště střevním escherichiím a ty se mu za to odvděčí tvorbou vitamínů) n vztah výhodný jen pro jednoho, druhému však nijak neškodí n oboustranně indiferentní vztah n antagonistický vztah (v důsledku vždy oboustranný) – virulentní kmeny Interakce mikrob – makoorganismus: obecně III Mnohé ze vztahů, o kterých byla řeč, souvisí i s.potravními řetězci: n komenzalismus – dělení se o potravu (např. naši střevní komenzálové) n saprofytismus – získávání energie ze zbytků (např. odumřelých epitelií) n parazitismus – dlouhodobé a postupné získávání energie ze živých buněk jiného organismu (× predace, která je jednorázová, krátkodobá) Virulentní mikroby jsou zpravidla parazitické. Nemusí ale být – škodlivost není přímo vázána na získávání potravy. Patogenita a virulence n Patogenita je vlastnost určitého druhu mikroorganismu způsobovat postižení makroorganismu. Obligátní patogeny jsou patogenní vždy, oportunní jen za určitých okolností n Virulence je vlastnost určitého kmene. V rámci patogenního druhu mohou být různě virulentní kmeny n Proti virulentním kmenům se makroorganismus brání Interakce mikrob – makoorganismus: mikroby napadající člověka n Mikroorganismy, které napadají člověka, jsou vybaveny různými faktory virulence – jsou to faktory, které zajišťují schopnost mikroba proniknout do organismu. Nejčastěji to bývají různé enzymy, toxiny, bakteriální pouzdro aj. n Makroorganismus se mikrobům brání řadou různých způsobů. Jde vždy o to, zda se více prosadí faktor virulence mikroba, nebo mechanismus obranyschopnosti makroorganismu Imunologický přehled n Imunologie coby věda o mechanismech obranyschopnosti úzce souvisí s.mikrobiologií jako oborem, ale i s.mikrobiologickou diagnostikou. Historicky se imunologie zrodila „z lůna mikrobiologie“ jako její podobor, později se osamostatnila a posunulo se její těžiště: vedle obrany proti infekci se dnes zabývá autoimunitou, protinádorové imunitě, a podobně. Nechci lézt imunologům do jejich zelí… n … ale neubráním se alespoň krátkému přehledu mechanismů obranyschopnosti organismu n nevím totiž, co vše z této oblasti víte či nevíte n některé věci z toho, co teď uslyšíte, budeme potřebovat v dalších částech výkladu n a konec konců, „repetitio mater studiorum“ (opakování matkou moudrosti) Základní rozdělení mechanismů obranyschopnosti organismu Anatomické bariéry a funkční mechanismy n Kůže – neporušenou kůží proniká jen málo mikrobů n Sliznice – zranitelnější, ale zase má spoustu mechanismů, jak čelit infekci n Funkční mechanismy: pohyb řasinek, kýchání, kašlání, smrkání, zvracení, průjem, močení (vypuzení proudem moče) n Prostředí nevyhovující mikrobům: nízké poševní pH, zvýšená teplota u viróz apod. Hrad Imunštejn n 1 – vnější hradba (kůže) n 2 – vnitřní opevnění (hematoencefalická bariéra) n 3 – dubová brána (sliznice – slabší než hradby, ale pevná) n 4 – stoka (teoreticky možnost vniknout dovnitř, ale proud odpadní vody brání vniknutí) n 5 – obránci hradu (buněčná imunita) n 6 – vylévání horké vody přes hradby (vylévání produktů toxických pro útočníka, humorální imunita) Nespecifická buněčná imunita n neutrofily – je jich nejvíc, krátká životnost, nedělí se, musí "uzrát" nové n monocyty (v periferní krvi) / makrofágy - (ve tkáních) – dlouhá životnost, mohou se dělit n eozinofily - zmnoženy u některých typů alergie a u infestací červy n bazofily (v krvi) / mastocyty (ve tkáních) – po aktivaci (kontaktu s cizorodým materiálem) uvolňují histamin a jiné látky n z lymfocytů NK-buňky (z angl. natural killer) přímo, bez imunizace zabíjejí cizorodé nebo i vlastní, ale "zvrhlé" buňky (nádorové, nakažené) Různé typy bílých krvinek Nespecifická humorální imunita 1 n Histamin a další látky uvolňované bazofily – rozvoj takzvaných atopických příznaků – rýma, astma, kopřivka n Komplement = 7 – 10 % sérových globulinů, hlavně z b-frakce; může být aktivován nespecificky (pomalu) nebo pomocí protilátek (rychle). Funkce: n chemotaxe – "přílákání" baktérií n opsonizace – "ochucení" baktérií, aby "chutnaly" leukocytům n podíl na ničení baktérií a jiných cizorodých faktorů Nespecifická humorální imunita 2 n Interleukiny – produkovány různými leukocyty po kontaktu s cizorodým materiálem, mnoho typů, funkce: n horečka (protože zvýšená teplota ničí některé mikroby, zejména viry) n mobilizace některých hormonů a naopak utlumení těch, které nejsou při infekci potřeba n spousta dalších vlivů na chování makroorganismu n Lymfokiny – produkovány některými lymfocyty, funkce: n "přilákání" a aktivace buněk, zodpovědných za zánět (neutrofily, makrofágy) n podpora množení aktivovaných lymfocytů n Interferon – účinný proti virům a některým nádorům Specifická buněčná imunita: zaměřená hlavně na nitrobuněčné parazity (viry, TBC) n Lymfocyty – vznik v kostní dřeni, vyskytují se hlavně v mízních uzlinách a slezině, při kontaktu s cizorodým materiálem se začnou mohutně množit n T-lymfocyty – zrají částečně v brzlíku – jsou zodpovědné za buněčnou imunitu n B-lymfocyty (v krvi) / plasmatické buňky (v.lymfoidních tkáních) – produkují protilátky specificky proti "svým" antigenům (viz dále) Specifická látková imunita – nejdříve co je to antigen a protilátka Co je to antigen? n je to cizorodá struktura, která vyvolává tvorbu protilátek (viz dále) n je to vždy makromolekula (bílkoviny, polysacharidy, nukleové kyseliny); malé molekuly jsou antigenní jen po navázání na makromolekulu Příklady antigenů n mikrobiální antigeny (různé povrchové struktury mikrobů – bílkoviny, polysacharidy apod.) n alergeny – antigeny ze zevního prostředí, které vyvolávají přecitlivělost n autoantigeny – vlastní antigeny, které se změnily a imunitní systém je přestal tolerovat n nádorové markery – změněné znaky na nádorových buňkách n histokompatibilní (HLA) – antigenní znaky na vlastních buňkách, význam při transplantacích, určení otcovství. Organismus jimi rozeznává "svoje" od "cizího" Protilátka (specifická humorální imunita) n protilátky – gama globuliny, v.séru i tkáních, produkovány B-lymfocyty. Protilátka se vždy vytváří jako odezva makroogranismu na podráždění určitým mikrobem. n účinky: n přímé zneškodnění – možné jen u virů a bakteriálních jedů, ne však (zpravidla) u celých baktérií n opsonizace ("ochucení" bakterií) n posílení funkce komplementu Třídy protilátek n IgG – největší část protilátek, začnou se tvořit později, ale po prodělané infekci zůstává celoživotně určitá hladina IgG proti danému mikrobu; á hladina ukazuje na chonic. infekci; procházejí placentou n IgM – velká molekula, placentou neprocházejí; tvoří se jako první při infekci i očkování; á hladina ukazuje na čerstvou infekci, nepřetrvává dlouho n IgA – hlavně na sliznicích (slizniční imunita) n IgD – stopová množství, funkce málo známá n IgE – souvisí s přecitlivělosti (alergií) Protilátky a mateřství n při narození má novorozenec nejprve IgG od matky n pak si sám začne tvořit své vlastní IgG a pak i IgM Lymfoidní tkáně – kde se soustřeďují buňky imunitního systému n lymfatické uzliny, slezina – obsahují hlavně T-lymfocyty a plasmatické bb. n roztroušené lymfoidní tkáně všude ve sliznicích, někde méně, někde (červovitý výběžek slepého střeva) více n pro imunitu nepostradatelná játra Poruchy imunity n Kvantitativní „mínus“: imunodeficity (vrozené či získané) n Kvantitativní „plus“: přemrštěná imunita, alergie a jim podobné reakce n Kvalitativní: imunita působí proti tomu, proti čemu nemá (autoimunita, napadající vlastní buňky) Imunodeficity (některé složky imunitního systému chybějí nebo jsou defektní) – 1 n Deficity nespecifické buněčné imunity (tj. hlavně různých bílch krvinek kromě lymfocytů) n sklon ke kožním infekcím a abscesům n léčba: transfúze leukocytárních koncentrátů n Deficity nespecifické humorální imunity (hlavně komplementu) n sklon k bakteriálním infekcím n léčba: mražená plasma (obsahuje komplement) Imunodeficity (některé složky imunitního systému chybějí nebo jsou defektní) – 2 n Deficity specifické buněčné imunity (T-lymfocytů) n sklon k infekcím virovým, parazitárním, plísňovým, tuberkulóze n do této skupiny patří i AIDS n Deficity specifické humorální (= protilátkové) imunity n chybí některé imunoglobuliny, sklon ke všem infekcím, hlavně bakteriálním n léčba: pacientovi se dodají čištěné imunoglobuliny, nejlépe lidské Imunologická přecitlivělost je chorobný stav nadměrné imunity n Alergie časného typu – atopická onemocnění n po kontaktu s alergenem (pyl, prach, roztoči, chlad, plísně, potraviny) se uvolní IgE, histamin a látky rozšiřující cévy n projevy mohou být různé, i podle typu kontaktu n alergická rýma n atopické astma ("záducha" v průduškách) n atopická dermatitida (kopřivka) n průjmy, zvracení, bolesti břicha n anafylaktický šok – nejzáva žnější, při proniknutí alergenu do krevního oběhu Další typy přecitlivělosti n Přecitlivělost pozdního typu n souvisí s buněčnou imunitou n po setkání se známým antigenem se projeví se zpožděním (24 – 48 h) n neinfekční záněty kůže – např. po chemikáliích; odvrhnutí štěpu (někdy až po letech); využití: tuberkulínová zkouška n Přecitlivělost cytotoxická a imunokomplexová n buňky poškozeny specifickými protilátkami a jejich komplexy s antigenem (imunokomplexy) – např.: transfúzní reakce, sérová nemoc, hemolytické anémie n Přecitlivělost stimulační n přecitlivělost vyvolává nadprodukci některých hormonů (např. štítné žlázy) Nemoci z autoimunity n porušena tolerance vlastních antigenů n např.: různé krvácivé a revmatické nemoci n příčina: zpravidla jistá antigenní „podobnost“ některých vlastních struktur s některými mikroby Imunoterapie (léčení imunopreparáty) (profylaxe, prevence i léčení chorob) n Imunizace – bude probrána příště n Imunosuprese – potlačení imunitních reakcí - u nadměrné nebo špatné imunity n Imunostimulace – povzbuzení nedostatečné imunity n Desenzibilizace – podávají se mikrodávky antigenu, aby si na ně organismus "zvykl" a nereagoval přehnaně; dávky se postupně zvyšují Úvodem k druhé části n V této části se již budeme zabývat mikrobiologickou diagnostikou, ale využijeme to, co jsme si řekli v části první. Nejvíc si pamatujme to, co jsme se dozvěděli o specifické humorální imunitě: je založena na interakci antigenu (v případě mikrobiálních antigenů jde o povrchovou část těla mikroba) s.protilátkou (imunoglobulinem, který je tvořen makroorganismem. Pro zopakování: Metody lékařské mikrobiologie n Přímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. n Nepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky) Typy mikrobiálních patogenů n Snadno kultivovatelné a mikroskopovatelné (stafylokoky, escherichie). Stačí poslat vzorek „na bakteriologii“, a ono z něj něco vyroste n Kultivovatelné / mikroskopovatelné speciálními metodami (mykobakteria, mykoplasmata…) n Nekultivovatelné (nebo jen velmi obtížně): používáme zpravidla nepřímý průkaz (spirochety, většina virů) Antigen a protilátka - opakování Antigen = makromolekula pocházející z.cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují v.hostiteli antigenní odpověď Protilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele jako odpověď na antigenní výzvu (samozřejmě nejen u.člověka, ale i u zvířat) Dva způsoby, jak to využít: Průkaz antigenu a antigenní analýza n V rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze ještě dále rozlišit dva podtypy: n Přímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku n Antigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) n U nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, kde hledáme protilátky Interpretace n Průkaz antigenu (včetně antigenní analýzy) je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v.těle pacienta n Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: n Množství protilátek (relativní – titr) n Třída protilátek: IgM/IgG (více v dalších př.) n (Avidita protilátek) Jak tyto informace zjistit n Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM n Pacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) n Chronická infekce: různé možnosti Jak provést reakci „kvantitativně“ n Je velmi těžké zjistit koncentraci protilátek v jednotkách mol/l, mg/l apod. n Ale dá se dělat jiná věc: mnohonásobně ředit pacientovo sérum. n Reaguje-li i po mnohonásobném ředění `a `a v séru je velké množství protilátky n Reaguje jen při nevelkém zředění séra `a `a jen malé množství protilátky Obvyklý způsob ředění: Geometrická řada n Můžeme vyjít z neředěného vzorku séra n V první zkumavce smícháme se stejným objemem diluentu (FR), `a ředění 1 : 2 n Polovina ředění 1 : 2 je přemístěna do další zkumavky a smíchána s opět stejným množstvím diluentu `a 1 : 4 n Jedna polovina z 1 : 4 …… `a 1 : 8 n Pokud vyjdeme z předředěného vzorku séra (např. 1 : 10), postupuje ředění od tohoto předředění (1 : 20, 1 : 40, 1 : 80). Pojem TITR Zapamatujte si: n Veškeré „srandičky“ typu titry, třídy protilátek, zjišťování avidity, slouží k odlišení akutní infekce, chronické infekce a stavu po dávno prodělané infekci. Týkají se pouze nepřímého průkazu! n Přímý průkaz totiž přímo prokazuje v těle pacienta část patogenova organismu. Není tedy nutné žádné další upřesněníů Typy serologických reakcí a jejich způsoby využití Precipitace, aglutinace, aglutinace na nosičích n Precipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromolekul (koloidní antigen) n Aglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby) n Aglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza) Schematické rozdíly Aglutinace k přímému průkazu n Průkaz antigenu ve vzorku n Aglutinace mozkomíšního moku pomocí komerčně dodávané soupravy (v.praktiku uvidíte video) n Antigenní analýza kmene n Sklíčková aglutinace či modernější na kartonových kartičkách (salmonely, EPEC, hemofily, meningokoky… Příklad: Antigenní analýza Enteropatogenní Escherichia coli n Většina kmenů Escherichia coli je „hodných“ n Ze všech antigenních typů E. coli je asi 12, které jsou „enteropatogenní“ – mohou dělat novorozenecké průjmy n Použijeme polyvalentní séra: nonovalentní obsahuje protilátky proti devíti typům EPEC, trivalentní proti dalším třem. Zákal = pozitivita n Pokud jedno ze sér (A či B) je „+“, musíme pokračovat s tri- a monovalentními séry n Je vám jasné, proč tu neurčujeme titry? Aglutinace k nepřímému průkazu n Reakce ve zkumavkách n Kdysi klasická, dnes spíše výjimečně, např. Widalova reakce u břišního tyfu n Mikroreakce v plastové mikrotitrační destičce n Ve většině situací nahradila klasické zkumavkové reakce. Používá se např. u tularemie, yersinií a mnoha dalších n Používá se i v případě aglutinace na nosičích, např. u TPHA Příklad: aglutinační rekace na průkaz protilátek u tularemie (ze stránky www.medmicro.info): Vzhled pozitivních a negativních jamek u tohoto typu aglutinace Pozitivní – nepravidelný chuchvalec Negativní – malé pravidelné kolečko Treponema pallidum haemaglutinace (TPHA) n Použijeme červené krvinky, na které je teprve navázán vlastní antigen T. pallidum (Dnes se v tomto testu červené krvinky nahrazují polycelulózovými částicemi – v tom případě jde o TPPA (T. p. polycelul. aglut.) n Tato reakce je sice nepřímý průkaz, ale nepoužívá se ředění a nezjišťují titry. Je to totiž screeningová reakce a případná pozitivita se ověřuje spolehlivějšími metodami Demonstrace TPHA (www.medmicro.info) Precipitace k přímému průkazu n Dnes už se prakticky nepoužívá. Jen pro zajímavost uvádíme dnes už historickou reakci k antigenní analýze kmene streptokoka n Tímto testem se z několika kmenů vybíralo, který je pozitivní v reakci se specifickým antisérem (tj. který náleží k dané séroskupině) Prstencová precipitace n Precipitace k detekci antigenu: n 1) zvířecí sérum s protilátkami n 2) čtyři různé extrakty kmenů n 3) pozitivita: na styku tekutin prstenec Precipitace k průkazu protilátek n Dnes už se také používá mnohem méně než dříve, přesto nějaká uplatnějí jí ještě zůstala n Precipitace v důlcích panelu, např. RRR (zvláštností jsou zde tzv. heterofilní protilátky) n Precipitace v agaru, např. dle Ouchterlonyho Příklad precipitace: RRR (rychlá reaginová reakce) n Detekce protilátek, které jsou pozitivní u syfilis, ačkoli to nejsou protilátky proti Treponema pallidum, nýbrž proti kardiolipinu (látka, která se objevuje u syfilitiků) n Takovým reakcím říkáme průkaz heterofilních protilátek – jsou to tedy protilátky, které nejsou zaměřené proti antigenu mikroba, ale proti jinému antigenu, který je v době výskytu mikroba přítomen v.těle pacienta Demonstrace jiného typu precipitace Tzv. mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho Pro dnešek děkuji za pozornost