Mykotické a parazitární infekce pro studenty PřF hlavně pro obor Obecná biologie Ondřej Zahradníček Dnes máme na programu n Přehled mykotických onemocnění člověka a jejich diagnostiky n Přehled parazitárních onemocnění člověka a jejich diagnostiky n V praktiku: n Nepřímý průkaz virů n Mykologická diagnostika – nasazení testů I. Mykologie Příběh první n Ellen se trápila. Její přítel jí vyčítal, že s ním nechce spát. Ve skutečnosti ji přítel přitahoval, jenže pokaždé, když se milovali, začalo ji to „tam dole“ nepříjemně svědit. n Což o to, už byla za svou gynekoložkou, a ta jí předepsala vaginální čípky. Čípky však pomohly jen na chvíli. n Ellen se už doopravdy naštvala. Změnila gynekologa. Nový gynekolog, vyslechnuv její příběh, pochopil, že lokální terapie nebude stačit. Až celková terapie vyhnala původce jejích potíží nejen z pochvy, ale i ze střevního rezervoáru. Tím její potíže pominuly. Viníkem byla Příběh druhý n Pan Leopold byl archivář. Celé dny trávil ve vlhkém a zaprášeném archivu. Postupně začal čím dál více pokašlávat. Chvíli se už obával, jestli snad nemá tuberkulózu, ale tuberkulóza to nebyla. Po zjištění pravé příčiny jeho potíží začaly Leopoldovy potíže ustupovat – pomalu, ale jistě. Viníkem zde byl n Aspergillus niger, neboli kropidlák černý n Kropidláky napadají častěji lidi oslabené, mohou však napadnout i člověka zdravého. Často se aspergilóza vyskytuje jako profesní onemocnění lidí, pracujících ve vlhkých, zaprášených provozech, kde neustále poletují různé plísňové spóry. Kropidlák černý Obecná charakteristika hub Houby a zdraví Některé jedovaté velké houby Klinicky významné houby Povrchové mykózy 1 Povrchové mykózy 2 n Odběry: šupiny z kůže, ústřižky nehtů, vlasů apod.; vždy je potřeba odebrat vzorek tak, aby bylo zachyceno místo, kde je zánět aktivní, a zároveň nezachytit kontaminace; doporučuje se i povrchová desinfekce (likvidace kontaminant z povrchu kůže) n Vlastní diagnostika: mikroskopická (nález vláken ve tkáni) a kultivační. Mikroskopická je důležitější – vykultivovat lze kontaminaci. n Léčba je zpravidla lokální (masti, šampony) Někteří původci Systémové mykózy 1 Systémové mykózy 2 Někteří původci Rod Candida 1 Rod Candida 2 Rod Candida 3 Někteří další zločinci Kolonie na krevním agaru: obtížné rozeznání n Přestože používáme pro houby speciální půdy, mnohé houby rostou i na bakteriologických půdách. A nejen to: některé, hlavně kandidy, volí rafinovaně podobu téměř nerozeznatelnou od kolonií bakteriálních n Rozeznat kolonie kandid od kolonií stafylokoků je někdy obtížné. Pomoci může vůně (po chlebu či burčáku); když nepomůže nic jiného, volíme zpravidla nátěr (mikroskopii) Gramovo barvení n Gramovým barvením jasně odhalíme, co je kvasinka, a co (jaká) bakterie. Mimochodem, pokud by šlo jen o odlišení kvasinek, stačil by nativní preparát či jednoduché barvení. n Pokud však mikrobiolog v praxi váhá např. mezi stafylokokem, kvasinkou a ještě gramnegativní nefermentující tyčinkou, je Gramovo barvení na místě k vyjasnění celé situace. n Pro ty, kteří si ani v desátém týdnu podzimního semestru nepamatují postup (což je ostuda): Violeť 30 s, lugol 30 s, alkohol 15 (až 20) s, oplach vodou, safranin 60 s, oplach Difúzní diskový test citlivosti na antimikrobiální látky n Až na výjimky platí, že antibakteriální látky jsou u mykotických onemocnění… ehm… zkrátka na houby J n Obdobně, antimykotika nepůsobí na naprostou většinu bakteriálních agens n Tento fakt si můžeme demonstrovat ve čtvrtém úkolu n Všimněte si, že houby nekultivujeme na MH, ale na Sabouraudově agaru K odečtu testů na antimykotika n U amfotericinu B se za citlivý považuje i kmen, který má malou zónu, pokud uvnitř této zóny nejsou viditelné kolonie n U ostatních antimykotik (těch, co končí na „-konazol“) naopak musí být zóna dost velká, ale připouští se i přítomnost „čehosi“ uvnitř zóny, pokud to „cosi“ svou intenzitou nepřesahuje 20 % intenzity růstu kolem zóny Než přejdeme dál: Co jsou to vlastně chromogenní půdy? n CHROMOGENNÍ půdy obsahují látku, která je původně nebarevná (chromogen) n Barevnost se objeví jen při specifické reakci (odštěpení substrátu) n Půda může obsahovat více chromogenů s.navázanými substráty specifickými pro různé bakterie nebo houby n FLUOROGENNÍ půdy jsou principiálně podobné, ale s fluorescenčním barvivem Chromogenní půda při diagnostice kandid n Používají se různé chromogenní půdy. Některé odliší pouze Candida albicans od ostatních, jiné rozliší vzájemně několik druhů kandid. n Budeme provádět pouze úkol 5 b, neboť Candiselect nemáme k dispozici. Na CHROMagaru je C. albicans zelenavá, C. tropicalis modrá, C. glabrata hladká růžová a C. krusei drsná růžová. Biochemická identifikace kvasinek n Tak jako bakterie, i kvasinky (ne však vláknité houby) se dají identifikovat biochemicky. (Však ostatně i použití chromogenní půdy je založeno na selektivním štěpení různých substrátů.) n Pokuste se určit předložené kmeny pomocí přiloženého návodu a porovnáním s tabulkou. n Kromě testu POX je žlutá pozitivní, modrá negativní n U testu POX je hnědá pozitivní, bezbarvá negativní n „V“ = variabilní – může vyjít „+“ i „-“ Mikroskopie a kultivace vláknitých hub n Diagnostika vláknitých hub se poněkud liší od diagnostiky kvasinek. Povšimněme si rozdílů: n Mikroskopie tu má větší význam. Lze pozorovat různé typy spor a konidií. Prohlížejte bez imerze, objektivem zvětš. 4× či 10×, 20×, popřípadě 40 × n Vzhled výsledků kultivace je značně odlišný, jak na Sabouraudově agaru, tak případně i na agaru krevním. Některé z nich, zejména dermatofyty, rostou velmi pomalu. To kvůli nim se Sabouraudův agar nalévá do zkumavek. Vyberte si libovolné tři kmeny a pokuste se je popsat. n Biochemické rozlišení se u nich, na rozdíl od kvasinek, zpravidla neuplatňuje. Mikroprecipitace v agaru n Z prostředního důlku difunduje antigen (na obrázku červeně) n Z pozitivního důlku se sérem číslo 2 (jen v našem příkladu – u vás to může být jiné číslo!!!) difunduje protilátka (na obrázku modře) n Z negativních důlků (séra číslo 1, 3, 4) samozřejmě žádná protilátka nedifunduje n V místě střetu antigenu s.protilátkou vzniká precipitační linie (na obrázku zeleně) Nepřímý průkaz mykóz Jednou z mnoha možností, jak jej provádět, je mikroprecipitace v.agaru. Probírali jsme ji už v tématu J.07. Precipitační linie se tvoří mezi důlkem s antigenem a důlkem s.protilátkou. II. Parazitologie A ještě jeden slovní: Víte, jaký je rozdíl mezi českým vědcem a tasemnicí? Příběh první n Nikolka se pořád škrabala v zadečku, že už to bylo nápadné rodičům i učitelkám ve školce. Zároveň byla neklidná a roztěkaná. A tak jí nalepili na zadek průhlednou lepicí pásku a poslali do laboratoře. A výsledek nikoho nepřekvapil. Nikolka tedy začala užívat léky, a zanedlouho byla zase úplně v pořádku… Viníkem byl Příběh druhý n Blanka měla delší dobu zvětšené uzliny, a pořád se nemohlo přijít na to, co jí je. Výtěry z krku nic neukázaly, ani výsledky dalších vyšetření nebyly průkazné n Blanka se chystala otěhotnět, a tak měla obavy. Jak se ukázalo, byly oprávněné: viník, zodpovědný za její uzlinový syndrom, totiž opravdu bývá těhotným nebezpečný… Viníkem totiž byla n Toxoplasma gondii, prvok, který je přenášen kočkami, i když se tvrdí, že chovatelé psů jsou ve větším riziku (protože na srsti donesou domů částečky kočičího trusu) n Většina infekcí u imunokompetentích osob je bez příznaků U některých osob ovšem může vzniknout například toxoplasmová retinitida… Příběh třetí n Jolana už zase měla jakési potíže „tam dole“. Nebylo divu, když spala každou chvíli s někým jiným. Tentokrát však bakteriologické vyšetření nepomohlo. Lékařka tedy zaslala k vyšetření soupravu C. A. T., a konečně byl na světě výsledek. Viníkem zde byla n Trichomonas vaginalis, česky bičenka poševní, bičíkovec, který se přenáší téměř výhradně sexuálně, i když výjimečně je možný i jiný způsob přenosu Trichomonádový výtok Tzv. jahodový cervix Příběh čtvrtý n Cestomil rád jezdil křížem krážem po celém světě. Po návratu z poslední cesty mu začalo být nějak divně, měl horečku, pak ho to přešlo, ale za tři dny se mu to celé zase vrátilo. Obvodní lékař ho poslal na infekční oddělení. Tam mu vzali krev a natřeli ji na dvě sklíčka – na každé jinak. Všichni tušili, kdo by mohl být pachatelem. A opravdu… Viníkem zde bylo n Plasmodium vivax, jeden ze čtyř druhý malarických plasmodií. n Malárie je celosvětově jednou z těch úplně nejzávažnějších chorob. Onemocní na ni denně mnoho lidí, včetně cestovatelů z Evropy. n Nejhorší průběh má „tropika“ neboli „maligní terciána“, působená P. falciparum. Mírnější jsou obě „benigní terciány“, působené P. vivax a P. ovale. Kvartána, působená P. malariae, je vzácná Klasifikace parazitů n Parazité jsou mikroskopičtí, klinicky významní živočiši*. Lze je členit dle umístění v.organismu, zoologických kritérií a dalších vlastností. n Mezi endoparazity (vnitřní parazity) patří: n Prvoci (améby, bičíkovci a další) n Hlístice (roup, škrkavka dětská, tenkohlavec, škrkavka psí a kočičí) n Motolice (motolice jaterní, schitosoma) n Tasemnice (tasemnice bezbranná a dlouhočlenná, škulovec, tasemnice dětská a rybí) n Mezi ektoparazity patří různí členovci Jiná klasifikace parazitů n Také bývá zvykem členit parazity podle orgánových soustav: n Paraziti střevní (od lamblií po tasemnice) n Paraziti krevní (intra- a extraerytrocytární) n Paraziti urogenitální (například bičenky) n Paraziti tkáňoví (například toxoplasma) Toto členění má význam i pro diagnostiku. U tkáňových parazitů má například logicky mnohem větší význam nepřímý průkaz – pro přímý průkaz nelze nalézt vhodný vzorek, který by měl být odebrán Střevní paraziti I Roup Střevní paraziti II Vajíčko škrkavky Střevní paraziti III Ancylostoma duodenale méně běžná střevní hlístice Střevní paraziti IV – tasemnice (vajíčka) Střevní paraziti V – tasemnice, článek Střevní paraziti VI – Diphylobotrium latum (škulovec široký) – méně běžná střevní tasemnice Střevní paraziti VII – lamblie Střevní paraziti VIII – měňavky (zde Entamoeba histolytica, trichrom) O. Zahradníček: V menze Šel jsem oběd naraziti V menze byli paraziti Škrkavky a lamblie Spolužačka tam… Různá vývojová stádia plasmodií Krevní paraziti II a III (přenašeč malárie, různá stádia, na další straně vývojový cyklus plasmodií) Krevní paraziti IV – Babesie (příbuzní malárií, vyskytují se i v Evropě) Krevní paraziti V Trypanosoma sp. – prvok (bičíkovec), Nahoře T. cruzi, dole T. brucei, a jejich přenašeči O. Zahradníček: Vánoce v Africe Veselé vánocece Přeje mi ráno tse-tse Krevní paraziti VI Filárie – extraerytrocytární krevní paraziti Krevní paraziti VII Filárie a trypanosoma – velikostní porovnání (ta kolečka jsou erytrocyty) Tkáňoví paraziti I Toxoplasma gondii Vánoce jsou, padá vločka toxplasmu nese kočka (z básně O. Z.) Tkáňoví paraziti II a III Leishmania sp. (na další stránce životní cyklus parazita a různé kožní i viscerální formy nemoci) Tkáňoví paraziti IV – Tenkohlavec bičíkový – Trichuris trichiura (vajíčko), tkáňová škrkavka Ostatní paraziti I Trichomonas vaginalis, česky bičenka poševní Ostatní paraziti II Acantamoeba sp. – prvok, oční Paraziti: diagnostické metody obecně n Důležitá je mikroskopie, buď nativní preparát. nebo barvení ( trichrom, Giemsovo barvení) n Kultivace se používá zřídka, prakticky jen u trichomonád a akantaméb. n Z jiných metod přímého průkazu se prosazuje v.poslední době PCR n Nepřímý průkaz se používá u tkáňových parazitóz, zejména toxoplasmózy, larvální toxokarózy a dalších Diagnostika střevních parazitů n Mikroskopie je v každém případě základem n Diagnostika vajíček červů, popř. článků tasemnic: n Používá se nativní preparát v různých modifikacích • U metody dle Kato se používá dobarvení pozadí malachitovou zelení, aby se paraziti zvýraznili • Faustova metoda je koncentrační (viz dále) • Grahamova metoda se používá jen u roupů (viz dále) n Diagnostika střevních prvoků (améb, lamblií) n Nativní preparát nestačí, používá se barvení, nejčastěji tzv. Gomoriho trichrom Faustova metoda n Princip spočívá v tom, že se stolice opakovaně smíchá s roztokem síranu zinečnatého a centrifuguje. Nakonec se roztokem doplní až po vršek zkumavky, překryje krycím sklíčkem, a to se pak opatrně přenese na podložní sklíčko, kde je již na druhé polovině nachystán preparát připravený dle Kato. Paraziti ulpívají na krycím sklíčku zespodu (viz obrázek) Poznámka k odběru stolice při vyšetření na střevní parazity n Posílá-li se stolice na parazitologické vyšetření (obvykle realizované kombinací metod Kato a Faust), je nutno – na rozdíl od bakteriologie – zaslat vzorek stolice velikosti lískového ořechu. Nádobka, ve které je zasílán, nemusí být výjimečně sterilní. Na rozdíl od virologického vyšetření není nutno chladit. n Vzorek velikosti kokosového ořechu (jak občas tvrdí někteří studenti) se nedoporučuje J Grahamova metoda v.diagnostice roupů n Spočívá v tom, že pacient se předkloní, roztáhne „půlky“, načež je mu na anální otvor (a hlavně perianální řasy) nalepena speciální průhledná lepicí páska. Ta je pak odlepena a nalepena na podložní sklíčko n Průhlednost pásky je zásadní, jinak dost dobře nelze mikroskopovat (Jsou i experti, kteří zasílají pásku neprůhlednou, anebo ji celou přelepí štítkem) n Je jednodušší než vyšetření stolice. Používá se však častěji u dětí – dospělí totiž mívají příliš chlupatou řiť, takže provedení metody by bylo obtížné a bolestivé Diagnostika krevních parazitů: Tlustá a tenká kapka n V diagnostice krevních parazitů je důležité provedení nátěru metodami tzv. tenkého nátěru a tlusté kapky. n Pro obě metody se používá čerstvá, nebo (provádí-li se nátěr až v laboratoři) nesrážlivá krev. Tenký roztěr se fixuje, tlustá kapka ne. Oboje se pak barví Giemsovým barvením. n Prohlédněte si obrázky na následující obrazovce a krátké videoklipy, z CD-ROMu „Parazite Tutor“. Tenký nátěr Tlustá kapka Diagnostika trichomonád n Trichomonády se v poslední době diagnostikují zejména kultivačně-mikroskopickým vyšetřením: n odebere se výtěr na tamponu zanořeném do média C. A. T. n médium se nechá kultivovat do druhého dne n kapka média se mikroskopuje jako nativní preparát. n Tyto preparáty však nelze uchovat n Proto v praktiku máme druhý možný způsob – nátěr na sklíčku barvený dle Giemsy. Je-li součástí MOP, označuje se jako MOP V. n Jiné možnosti (např. fluorescenční barvení jako na obrázku) se používají jen výjimečně. Diagnostika ostatních parazitárních nákaz n U ektoparazitů leží diagnostika z větší části mimo rámec mikrobiologie – vši spatří i laik, zákožky případně dermatolog n U tkáňových parazitů se zasílá zpravidla sérum n V některých případech, zejména tropických parazitóz, je lépe konzultovat odběr a jeho provedení s laboratoří U některých filarióz se doporučuje provádět odběr pouze v noci, popř. pouze ve dne Nashledanou při dalším dílu!