Lékařská virologie -
                                            přímý průkaz

                                  Pro posluchače PF MU Brno, 2006

                  Doc. MUDr. Vlastimil Obdržálek, CSc, Mikrobiologický ústav LF MU

                                    Diagnostika virových infekcí

•      Přímý průkaz virů :                                    kultivace (je zdlouhavá a drahá) 
          průkaz antigenů imunologickými nebo genetickými
metodami                                  

•      častěji je užíván nepřímý průkaz virů, tedy stanovení protilátek proti nim

                                    Metody přímého průkazu viru

•      Elektronová mikroskopie - v rutinní dg. se neužívá

•      Optickým mikroskopem prokazujeme jen poxviry a virům podobné bakterie (chlamydie a
rickettsie)

•      V buňce vidíme virové inkluse      (vzteklina, trachom, cytomegalie)

                                   Průkaz virových antigenů-ELISA

•      v jamce je výrobcem navázána protilátka

•      z klin. materiálu (např. séra) se naváže na protilátku antigen viru, promyjeme

•      přidáme  tzv. konjugát  (protilátka proti imunoglobulinu s navázaným enzymem

•      po promytí přidáme substrát, který je štěpen enzymem, přičemž vzniká zbarvení,    reakci
zastavíme kyselinou, zbarvení měříme fotometrem.

                                                    

•      Naměřenou extinkci srovnáváme s hraniční hodnotou tzv. cut off

•      Výsledek udáváme jako pozitivní nebo negativní, v některých případech jako Index pozitivity,
tj.. podíl extinkce a cut off

•      Použití: u hepatitidy B (HBsAg  australský antigen), u viru chřipky, parachřipky,      RS-
viru a u chlamydií 

                                    Jiné metody přímého průkazu

•      Imunofluorescenční metody  nahradily průkaz inkluzí

•      australský antigen se dříve prokazoval precipitací v gelu

•      RIA - radioimmunoassay se nevžila, diagnostické laboratoře nejsou většinou  vybaveny pro
práci s izotopy

                                          Genetické metody

•      Genetické sondy - užití papilomaviry, rozeznáme vysoce onkogenní typy,             u HCV
prokazuje akutní infekci, v době kdy nejsou prokazatelné protilátky

•      PCR - HIV, HBV, HCV, EBV, HHV6 a 7, CMV

                                      Izolace viru (kultivace)

•      Viry nerostou na bezbuněčných půdách

•      Izolovat je můžeme:

  –    na zvířatech

  –   na kuřecích zárodcích

  –   na tkáňových kulturách

•      virologické metody rozvíjeny významněji   až po 2. světové válce

                                     Pokusná zvířata, očkování

•      Bílá myš je symbolem nejen psychiatra, ale  virologa

•      intracerebrálně - virus klíšť. encefalitidy virus herpes simplex, u ornitosy
intraperitoneálně

•      sající myšata - coxsackieviry sk. A, reoviry

•      morčata - virus kulhavky a slintavky

•      pokusné zvíře uhyne, změny na orgánech

                                           Kuřecí zárodek

•      Struktura:                                                   pod skořápkou membrana
papyracea                 pod ní chorioalantoidní membrána                alantoidní vak (10
ml)                                  amniový vak (3 ml) v něm                                  
zárodek (velké oko a zobák),  na břišní straně žloutkový vak (dg. chlamydií, rickettsií)

•      Vejce prosvítíme a zubařskou vrtačkou odbrousíme skořápku nad vzduchovou bublinou

                                     Očkování kuřecího zárodku

•      Do amnia: Virus chřipky- aplikujeme 0,2 ml jehlou (směrem k oku), zalepíme leukoplastí a
voskem, inkubace 3 dny

•      Do alantois: aplikujeme  až  0,5 ml (jen adaptované kmeny viru chřipky). Po 3 dnech vejce
asepticky otevřeme a v tekutině prokazujeme Hirstovým testem viry (aglutinují erytrocyty) 

•      Na choriolalantoidní membránu: Užíváme u poxvirů, očkujeme pod skořápku, vytvoří se poky.



                                         Tkáňové kultury I

•      Buňky primární - připravené z orgánů, dají se jen 2-3x pasážovat

•      Buňky liniové - lze pasážovat mnohokrát (často nádorové buňky)

•      Pro kultivaci TK nutné nejčistší chemikalie, redestilovaná voda ve skle, speciální sklo dnes
užíváme plasty, zkumavky nebo Rouxovy (čti Rů) láhve



                                         Tkáňové kultury II

•      Media : Parker, Eagle, MEM medium.

•       Media obsahují : soli, AA, glukosu, růstové faktory, ATB, fenol. červeň,  pH indikátor, + až
20 % telecího séra

•      Liniové buňky: HeLa (ca cervicis uteri)

•      Primární buňky: OL (opičí ledviny), LEP (lidské embr. plíce) - dodáváno z Prahy

                                        Tkáňové kultury III

•      TK kultivujeme při 37 C několik dnů

•      Buňky vytvoří na stěně Rouxovy láhve jednovrstevný list buněk (monolayer)

•      Po naočkování materiálem  dochází k morfol. změně buněk (cytopatický efekt)

•      Tento pozorujeme malým zvětšením přes stěnu láhve nebo zkumavky.

•      CPE je charakteristický, jindy se nevytvoří



                                        CPE a dourčení viru

•      Pikornaviry: Zakulacené bb.,alkalizace

•      RS-virus a viry parainfluenzy: Syntitia

•      Poxviry: Ložiskový CPE

•      Herpesviry: Malá syntitia, balonovité bb.

•      Virus chřipky: Bez CPE, hemadsorbce

•      Virus zarděnek: Bez CPE, interference

•      Enteroviry: Přežití 80 C s Mg ionty

•      Obalené viry: Citlivost k eteru