J04 – Biochemická identifikace

                                         Ondřej Zahradníček

                                K praktickému cvičení pro VLLM0421c

                                          Kontakty na mne:

                                            777 031 969

                                        zahradnicek@fnusa.cz

                                          ICQ 242-234-100

                                     Postavení v systému metod

n   Přímé metody (mikrob – část – produkt):

  n  Mikroskopie – průkaz ve vzorku i id.

  n  Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace

  n  Biochemická identifikace – jen identifikace!

  n  Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id.

  n  Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku

  n  Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku

n   Nepřímé metody (protilátky)

                                           Obecný princip

n   I mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano

n   Mezi bakteriemi velké rozdíly v produkci různých enzymů. Někdy jsou mezidruhové, avšak jsou i
mezi kmeny

n   Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v
produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor

                                          Pro připomenutí…

Jestlipak víte, že jste se s takovým biochemickým testem už vlastně setkali? Že ne? Ale ano, v
minulém praktiku. ENDOVA PŮDA v sobě také

                                              Problémy

n   Málokdy pozorujeme, že 100 % či 0 % kmenů určitého druhu tvoří daný enzym

n   Častěji je to 90 %, 10 %, 70 %, 30 %…

Pokud např. víme, že Janičkella tvoří lenkulázu v 90 % a Evičkella v 10 %, pak lenkuláza-pozitivní
mikrob sice může být typická Janičkella, ale také atypická Evičkella

n   Proto lze-li, sledujeme více znaků než 1

                         Možnosti praktického provedení – 1 (rychlé testy)

n   Katalázový test (Ú2): velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H[2]O[2]) rozmícháme bakterie.
Bublinky = pozitivita

n   Testy s dg. proužky – oxidáza (Ú1), PYR-test a podobné. Reakční ploškou se dotkneme kolonií. V
případě pozitivity ploška změní barvu. Někdy je nutno několik minut vyčkat (INAC u dg. moraxel),
někdy vyčkat a pak ještě přikápnout činidlo (PYR-test).

                         Možnosti praktického provedení – 2 (inkubace 24 h)

n   Jednoduché zkumavkové testy: do zkumavky se dá substrát (a indikátor). Pozitivita testu = změna
zbarvení (arabinóza). Substrát se může přidat i na proužku (ONPG-test, Ú3).

n   Složité zkumavkové testy: v jedné zkumavce více reakcí, např. zbarvení tekutiny + prstenec +
zákal (MIU, Ú5). Nebo jsou substráty (více než jeden) v.pevné půdě (Hajnova půda Ú4).

                                     Ú4 Hajnova půda - princip

n   Barva spodní části půdy beze změny: baktérie nefermentuje glukózu (rozdíl tzv. G- neferm. tyčky
× enterobakterie)

n   Spodní část zčerná – tvorba H[2]S

n   Půda potrhaná, s bublinkami – tvorba plynu z glukózy

n   Dolní část žlutá, horní červená – bakt. fermentuje glukózu, ale ne laktózu

n   Půda celá žlutá – fermentuje i laktózu

                                           Ú5 MIU princip

n   Motility – pohyb. Pohyblivé bakterie rostou nejen kolem vpichu, ale v celém objemu zkumavky.

n   Indol (tvorba). U bakterií tvořících indol se po přídání Kovácsova činidla vytvoří červený
prstenec na styku činidla a půdy

n   Urea (močovina). Štěpení močoviny – celý objem půdy zrůžoví

                                   Hajna + MIU – vyhodnocení (Ú6)

                        Možnosti praktického provedení – 3 (opět min. 24 h)

n   Miniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů `a testy v důlcích plastových mikrotitračních
destiček. Místo každé zkumavky je jeden důlek

n   Sady obsahují zpravidla 8 až 32 testů

n   Liší se v technických detailech. Vždy je však substrát lyofilizovaný, bakterie se nejprve
rozmíchá ve FR nebo suspenz. médiu a pak se kape či lije do důlků

                                   Různé typy testů v „panelech“

n   U nás se užívají testy fy Pliva-Lachema Brno (zde NEFERMtest 24)















n   Ve světě existují různé produkty

                                    Co se po vás chce v Úkolu 7a

n   Nachystejte si destičky, které jsou vcelku (EnteroTest 2). Odhrňte si jeden řádek, ve kterém
ještě není tekutina.

n   Do jedné širší zkumavky se zlatým kloboučkem vyžíhanou kličkou vmíchejte bakterie. Kličku opět
vyžíhejte

n   Kapátkem suspenzi ze zkumavky přeneste do jednoho řádku destičky

n   Nyní by se destička dala přes noc do 37.°C (Ta vaše je jen cvičná, vyhodí se)

                                    Vyhodnocení testů (Úkol 7b)

n   Všechny reakce se odečtou. Někdy též reakce se zbytkem susp. ve zkumavce

n   (1) Porovnání s tabulkou: nepraktické.

n   (2) Někdy se výsledek zadá do počítače, který „vyplivne“ výsledek.

n   (3) Nejčastěji se vypočítá oktalový kód výsledek vyhledá v seznamu kódů.

                                     Konkrétně u ENTEROtestu16
                              (530 063 = E. coli, 99,89 %, T[in]=1,00)

                                      Charakteristika výsledku

n   Ať už v seznamu kódů, nebo ve výstupu počítače, je výsledek charakterizován:

  n  % pravděpodobnosti: např. že je 90% pravděpodobnost, že kmen opravdu je Janičkella elegans a ne
  něco jiného

  n  Index typičnosti: míra shody s „ideálním kmenem“ Janičkella elegans. Pokud je kmen ideální, je
  T[in] = 1,00; pokud kmen např. netvoří lenkulázu, ačkoli 90 % janičkel ji tvoří, bude T[in] nižší
  než 1,00

                                    Přeji Vám hezký zbytek dne…