Úvod do sérologie, aglutinace a precipitace, ředění (téma J07)

                                   Metody lékařské mikrobiologie

n   Přímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Mikroskopie, kultivace, biochemická
identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno.

n   Nepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v
minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky)

                                        Antigen a protilátka

Antigen = makromolekula pocházející z.cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. V
mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují
v.hostiteli antigenní odpověď

Protilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele jako odpověď na antigenní výzvu (samozřejmě
nejen u.člověka, ale i u zvířat)

                                    Dva způsoby, jak to využít:

                                            Interpretace

n   Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta

n   Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy
přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal:

  n  Množství protilátek (relativní – titr)

  n  Třída protilátek: IgM/IgG (více v J10)

  n  (Avidita protilátek)

                                     Jak tyto informace zjistit

n   Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM

n   Pacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť)

n   Chronická infekce: různé možnosti

                                 Jak provést reakci „kvantitativně“

n   Je velmi těžké zjistit koncentraci protilátek v jednotkách mol/l, mg/l apod.

n   Ale dá se dělat jiná věc: mnohonásobně ředit pacientovo sérum.

  n  Reaguje-li i po mnohonásobném ředění `a `a v séru je velké množství protilátky

  n  Reaguje jen při nevelkém zředění séra `a  `a jen malé množství protilátky

                                      Úkol 1: Geometrická řada

n   Vycházíme z neředěného vzorku séra

n   V první zkumavce smícháme se stejným objemem diluentu (FR), `a ředění 1 : 2

n   Polovina ředění 1 : 2 je přemístěna do další zkumavky a smíchána s opět stejným množstvím
diluentu `a 1 : 4

n   Jedna polovina z 1 : 4 …… `a 1 : 8

n   Atd., atd.

                                               Úkol 2

                          Precipitace, aglutinace, aglutinace na nosičích

n   Precipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromolecul (koloidní antigen)

n   Aglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby)

n   Aglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na nosič (latex, erytrocyt)

                                        Schematické rozdíly

                                   Úkol 3a: Protilátky aglutinací

n   3a: Určete aglutinační titry u protilátek proti tularemii (z technických důvodů místo yersinií)

n   Pozitivní – nepravidelný chuchvalec, negativní – malé pravidelné kolečko

                       Demonstrace aglutinační rekace (z www.medmicro.info):

                             Úkol 3b: Enteropatogenní Escherichia coli

n   Existuje cca 12 antigenních typů patřících mezi EPEC

  n  Použijeme polyvalentní séra: sérum A obsahuje protilátky proti některým typům EPEC, sérum B
  proti zbývajícím. Zákal = pozitivita

  n  Pokud jedno ze sér (A či B) je „+“, musíme pokračovat s monovalentními séry

n   Je vám jasné, proč tu neurčujeme titry?

                          Úkol 4: Treponema pallidum haemaglutinace (TPHA)

n   Technicky totožné z úkolem 3a, avšak:

n   Rozdíl 1: dělá se to jen kvalitativně (titry se neurčují)

n   Rozdíl 2: je to červené (protože místo bakterií použijeme červené krvinky)

                                            Demonstrace
                                                TPHA
                                        (www.medmicro.info)

                                        Úkol 5: precipitace

n   Úkol 5a: Detekce protilátek, které jsou pozitivní u syfilis, ačkoli to nejsou protilátky proti
Treponema pallidum, nýbrž proti kardiolipinu (látka, která se objevuje u syfilitiků)

n   Opět pouze kvalitativně. První důlek je pozitivní kontrola, druhý negativní, pak má každý
pacient (jen!) jeden důlek

n   0,05 ml séra + 0,05 ml kardiolipinu

Z technických důvodů není úkol k mání

                                Demonstrace jiného typu precipitace

Tzv. mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho

                                    5b – prstencová precipitace

n   Precipitace k detekci antigenu:

  n  1) zvířecí sérum s protilátkami

  n  2) čtyři různé extrakty kmenů

  n  3) pozitivita: na styku tekutin prstenec

                             U mikrobiologie zase za týden nashledanou!