Reakce se značenými protilátkami (J10) Pro zopakování n Cílem mikrobiologických metod je zpravidla detekce patogena, popř. určení jeho citlivosti na antimikrobiální látky. n Patogena určujeme n Přímými metodami n detekce celého mikroba (jako morfologické či fyziologické jednotky) n detekce jeho části (antigenu, DNA) n detekce jeho produktu (například toxinu) n Nepřímými metodami: detekce protilátek Všechny sérologické metody Interpretace – doplněné opakování n Průkaz antigenu je přímá metoda (P). Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta. n Průkaz protilátek je nepřímá metoda (N). Jak u ní ale odhadnout, kdy se mikrob s.tělem pacienta setkal: n Zjištění titru a určení jeho dynamiky (klasické metody) n Třída protilátek: IgM/IgG, popř. IgA n (Avidita protilátek) Mějte stále na paměti n Tam, kde prokazujeme antigen, je nesmyslné hovořit o titrech, jejich dynamice, o třídách protilátek apod. Pokud kvantifikujeme, tak jen pro odlišení případné falešné, nespecifické pozitivity n U průkazu protilátek klasickými metodami sledujeme titr a jeho dynamiku n U reakcí se značenými složkami zpravidla titr neurčujeme. Místo toho zjišťujeme pozitivitu v třídách protilátek Průběh protilátkové odpovědi n Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce n Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou Protilátky ostatních tříd n Protilátky třídy IgA se u některých infekcí vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální) n Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi n S protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje Reakce se značenými složkami n Na povrch se postupně navazují jednotlivé složky n Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje n Je-li to pravda, složka se naváže n Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec n Na konci řetězce je vhodné značidlo Promytí a jeho význam n Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní n Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch n Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení Průběh pozitivní reakce (možnost se třemi složkami – mohou být jen dvě) Průběh negativní reakce (možnost se třemi složkami) Typy značidel n Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence n Radioizotop je značidlem u reakce RIA n Enzym je značidlem u reakce ELISA n Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc. Možnosti uspořádání složek červeně vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta n Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) n Povrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) n Povrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) n Povrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) Konjugát je protilátka namířená proti lidské protilátce Význam konjugátu n Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) n Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG n Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky n Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek Příklad reakce ELISA použité k detekci protilátky Úkol 1 a úkol 2 Přímá imunofluorescence n (Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) Nepřímá imunofluorescence n (Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce) ELISA – proč je tak oblíbená n U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. n Nenáročnost z hlediska nákladů a nulové radiační nebezpečí je výhodou oproti radioimunoassayím n Možnost automatizace je velkou výhodou oproti imunofluorescenci ELISA – praktické provedení n Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry n Před vlastními důlky pacientů bývá: n Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) n K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola n Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitiv. výsledky) ELISA – ukázka (www.medmicro.info) Úkol 3: ELISA, průkaz antigenu n U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá n Intenzitu zbarvení lze měřit spektrofotometricky n Za pozitivní se považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ n V našem případě se cut off počítá jako n (A1 + B1 + C1)/3 + 0,050 Úkol 4: ELISA, průkaz protilátek n U nepřímého průkazu reakcí ELISA se zpravidla hodnotí zvlášť protilátky IgM a IgA n Za pozitivní se opět považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ n V našem případě se cut off počítá jako (B1 + C1)/2 + 0,320 n Výsledky mezi 90 % a 110 % cut off se hodnotí jako „hraniční“, pod 90 % jako „negativní“, nad 110 % jako „pozitivní“ Western blotting n Název – slovní hříčka (badatel Southern) n Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty n Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů Western blot – vzhled (obrázek z www.medmicro.info) Úkol 5 – Western blotting n Alespoň dva specifické pruhy (zvýrazněné na šabloně) `a hodnotí se jako pozitivní n Výjimky: n u IgG stačí, je-li pozitivní jen vlsE (je vysoce specifický) n u IgM stačí, je-li pozitivní jen ospC (je vysoce specifický) Hezký den!