I "■ ^^ů""- '-vvTÍrůí.- ■ ■"■■ "■■"■ "■■■■"■ .■■."-:". ■      -  ■■■ "■ ■■" ■■:!■ ':•'•'' "■■■ ■ ■"■■ ""■''.   ■" ■■■■■■■■■■"-:"-.": ■""■" ■ ".■■■ "■ ■■" ■ .■■."-: "-.■ ■ ■"■■ ""■"!  .v.".-.-!.■ ■■"■"■. .•••''.   . ■■ "■ ■■". ..-. ."■■ "■■".   ■■■ "■■■■. ■".. --: "■_. ■ ■"■■ ""■ "■■''.   ■.■""■ .V-".
I.1" ■? * ,^-:"i \!^",^>K^^,■■ '■""■' "v/?-: ■      "■.■ ■" ■"■"."'        I ■ ■■■'■"■: '•?•'   '. ■ ■"' ■"■ ■ .'v/?-1"   ■ ■■.■'■""   ■.■ ■"' ■"■'.■ " "■"■.■"■■■■■"■: ■      "■.■ ■" ' ■"■ ■ .'v/?-1"   ■"■■■ ■ '■"■ "■.■ ■■■■""■ .■■.■" .   ■..'."■:'.       .. ' ■.■/?■"- ■ •••'•*• ■■■'■"■: ■.■ ■"' ■"■ ■ .t,:':\t "■■■■   ■!■! "'•':'-.
.^." ■ ^.
j^^%r
Kontakt
.■«.   ■.■«.■ '..'."" ■■.■
Pro zopakování
rcujeme
Přímými metodami
■ detekce celého mikroba (jako morfologické či
detekce jeho části (antigénu, DNA) detekce jeho produktu (například toxinu)
e pří mým i metod a m i: dete kce proti látek
.■«.   ■.■«.■ '..'."" ■■.■
Přehled metod -
mBMywJl^e^Mi^Mtv^%
JMíkrlikope^^
Biochemické a podobné identifikační metody
!                                                                                                !                                                                                                !                                                                                                !                                                                                                !                                                                                     :     .!
Průkaz antigénu (pomocí protilátky)

merazova re velmi citl^ ĚĚmm
^r V  ■
■               jr
z     r\r
podobná (ale zavedla ji jiná firma)
růkaz vírové RNA je možný pomocí
Naším cílem je seznámit studenty
ižitelnosti těchto
v a
jr   ■
problematiku ve 3. - 5. ročníku rád
ema reakce
v^ i ^r
ruhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje odpovídající příslušnému primeru
Ve třetí fázi probíhá detekce produktu
Gelovou elektroforézou nebo
Metodou ELISA {* serologická ELISA!!!)
.■«.   ■.■«.■ '..'."" ■■.■
Použití metod průkazu DN
obtížnv
není vůbec možný
ehodí se příliš pro běžné
va
■i    r
mm
^%r *^^sr w
svou
Metody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí, ani samospasitelné, jak si í pro změnu jiní
Ke 500 \d materiálu (pokud je objem materiálu menší, je nutno doplnit do 500 ^
fyziologickým roztokem) přidat 25 ^i] SARKOSYLu, inkubovat při 56 °C/15 min>, v proběhu
inkubace občas vortexovat
Přidat 1,0 mi roztoku Gl, vortexovat, inkubovat při 65°C/10 min, vzorek zchladit na RT.*
Přidat 50 jíl SILICA .obracením promíchat (10 min.).**Centrifugovat při 6 000 g/30 sec,
supernatant slít.
Přidat 1 mí roztoku G2, vortexovat, centrlfugovat při  6 000 g/30 sec, supernatant slít.
Přidat 1 ml 80% Etanolu, vortexovat, centrifugovat při 6 000 g/30 sec, supernatant slít.
Přidat 1 ml 80% Etanolu, vortexovat, centrlfugovat při 6 000 g/30 sec, supernatant slít,
Přidat 1 ml Acetonu, vortexovat, centrifugovat 6 000 g/60 sec, supernatant ihned opatrně
slít.
Pelet vysušit (max. 2 min.) v otevřené zkumavce.
Přidat 50 fil roztoku TE (předehřátého na 56 °C), dobře protřepat.
Eiuovat DNA při 56 °C/10 min., krátce vortexovat nebo protřepat.
Centrifugace 10 000- 14 000 g/2 min./RT.
Grv roztok, DNA odebrat ihned po centrifugaci do sterilní mikrozkumavky
a jemu příslušných primem ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je
I
Ovšem pozor: IC muže vysoce pozitivníc
negativní u
v
o n
Možné výsledky
wsmm
ivní výsledek vzorku při pozitivním
!                                                                                                !                                                                                                !                                                                                                !                                                                                             '
!                                                                                                !                                                                                                !                                                                                             ,
= negativní výsledek reakce kilCnéaativ
.■«.   ■.■«.■ '..'."" ■■.■
Úkol 3: Detekce výsledků PCR
Produkty putují gelem od katody směrem Ĺj^;BnM§:#ÍSQU^idit^:aaý
■     :  r:
kazka gelu (3 vzorky, pozitivní a
k* f.  ť v   k-
v^
potřebujeme kombinaci výsledků různých reakcí.
V daném případě máme k dispozici výsledek PCR a výsledek reakce ELISA
í me mítna paměti, že ELISA k
je primy
.■«.   ■.■«.■ '..'."" ■■.■
Úkol 5: Průkaz produktu PCR
I
metodou ELISA
Zde však nejde o sérologické použití reakce, ale o roduktu PCR. Proto i zde máme vedle důlku vzorku také důlek patřící IC.
Konkrétní způsob výpočtu je uveden listu s hodnotami absorbancí