Klinická virologie I (J12)

                                 Přehled metod – a které využijeme:

n   Přímé metody (práce se vzorkem či kmenem)

  n  Mikroskopie (nativní preparát, barvení…)

  n  Kultivace (na tekutých i pevných půdách)

  n  Biochemické a podobné identifikační metody

  n  Průkaz antigenu (pomocí protilátky)

  n  Pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity)

  n  Průkaz nukleové kyseliny

n   Nepřímé metody

  n  Průkaz protilátek (pomocí antigenu)

                                      Virologická diagnostika

n   Kultivace `a izolace Vyžaduje živé buňky.

n   Mikroskopie: elektronoptická, optická jen k průkazu něčeho, co viry dělají in vivo či in vitro
(inkluze, cytopatický efekt)

n   Biochemická identifikace nepadá v úvahu

n   Pokus na zvířeti zde splývá s izolací viru

n   Průkaz DNA – u virů > u bakterií

n   Průkaz AG ve vzorku – velmi běžný

n   Nepřímý průkaz – obvykle základem veškeré diagnostiky virů

                                            Izolace virů

n   Zvíře se používá dnes již méně často. Klasickým zvířetem je sající myše.

n   Vaječný zárodek je klasickou metodou

  n  Amniová dutina

  n  Alantois

  n  Žloutkový vak

  n  Chorioalantoidní membrána (pouze zde někdy pozorovatelný výsledek – tzv. poky)

n   Tkáňové kultury: LEP, HeLa, opičí ledviny a různé jiné. Některé viry dělají na TK cytopatický
efekt (CPE)

                            Jak prokážu virus, když ho není nijak vidět?

n   Bakterie při kultivaci tvoří viditelné kolonie, nebo aspoň kalí bujón. Naproti tomu, jen někdy
vidíme výsledek izolace viru (CPE, poky), mnohem častěji výsledek viditelný není

n   Izolovaný virus tedy musíme nějak prokázat, třeba průkazem antigenu

n   Klasickou metodou je Hirstův test – průkaz schopnosti viru shlukovat krvinky

                                      Mikroskopie ve virologii

n   Elektronová mikroskopie je vhodná k.pozorování většiny virů. Je však velmi nákladná a není vždy
dostupná

n   Optická mikroskopie se dá použít

  n  K pozorování velikých virů (poxviry)

  n  K pozorování buněčných inkluzí in vivo (Negriho tělíska u vztekliny)

  n  K pozorování cytopatických efektů in vitro (řada různých virů)

                        Úkol 1: aplikace inkoustu („viru“) do amniové dutiny

n   Vejce prosviťte v ovoskopu

n   Odřízněte skořápku nad vzd. bublinou

n   Na papírovou blanku kápněte alkohol

n   Vejce opět prosviťte v ovoskopu

n   Jehlou se jakoby snažte vypíchnout oko kuřecímu zárodku (ono stejně uteče)

n   Aplikujte inkoust

n   Případně si zkuste vejce zavíčkovat

n   Vejce rozklopte a sledujte výsledek

                                            Další úkoly

n   Úkol 2: Proveďte dle návodu. Po inkubaci by mělo být patrné virové shlukování krvinek

n   Úkol 3: Proveďte nepřímý průkaz viru klíšťové encefalitidy pomocí HIT

n   Úkol 4: Proveďte nepřímý průkaz několika virů pomocí KFR

n   Úkol 5: Strčte si do mikroskopu celé zkumavky tak jak jsou, snažte se zaostřit na vnitřní stěnu.
Možná uvidíte TK, v některých možná i s CPE.

                                     Připomenutí k úkolům 4 a 5

n   U HIT je pozitivní zábrana virového shlukování krvinek, negativní shlukování

n   U KFR je pozitivní nepřítomnost hemolýzy, negativní hemolýza

n   Titr je nejvyšší ředění, kde je ještě reakce pozitivní

n   Čtyřnásobný vzestup/pokles titru se považuje za signifikantní při použití párových sér

                           Úkol č. 6 – shell-vials techniky (demonstrace)

n   Jde o techniky urychlené kultivace. Jsou v poslední době velice populární. Je to přímý průkaz, a
přitom není tak zdlouhavý a komplikovaný jako klasická izolace viru

                                             Hezký den!