Vítejte po prázdninách opět na mikrobiologickém ústavu! NA STOPĚ PACHATELE Díl první: Pachatelem je stafylokok Mikrobiologický ústav uvádí Příběh první n Paní J. K., kuchařka ve studentské menze. Má na ruce puchýř, naplněný žlutobílým hnisem. Nevěnuje mu však pozornost. Bere do ruky knedlíky, které se už nevaří, ale jen prohřívají n Student Miloš s přítelkyní si pochutnají na knedlíkách. Odpoledne mají schůzku … ale co to? Půl hodinu před schůzkou Miloše najednou zničehož nic rozbolelo břicho. Na WC neví, který konec trávící trubice nastavit vstříc míse dřív… Volá přítelkyni – ta má ale pochopení, je na tom stejně… Romantické odpoledne se nekoná… Kdo je vinen? n Vinen je Staphylococcus aureus název z řeckého staphylé = hrozen n Tento „zlatý stafylokok“ s oblibou způsobuje hnisavé infekce kůže a kožních adnex n Některé kmeny produkují enterotoxiny, které fungují jako tzv. superantigeny n Intoxikace bakteriálním toxinem se, na rozdíl od střevní infekce, projeví velice rychle; obvykle také rychle odezní Vinna je ovšem také kuchařka, která nedodržela pravidla hygieny a nevšímala si puchýře! Příběh druhý n Studentka P. Z. je nervózní: opět na ni přišly „její dny“. Naštěstí má ty slevněné tampóny, které nedávno výhodně koupila. n Najednou ji chytila třesavka, mdloby, horečka. Spolubydlička ji našla ležící na koberci a volá 155. Objevila se vyrážka, leží na JIP infekční kliniky… Kdo je vinen tentokrát? n Také tento toxin je superantigenem n Způsobuje toxický šok, typicky se vyskytuje u uživatelek menstruačních tampónů Příběh třetí n Mladík F. B. se zotavuje po těžké havárii. Do krevního řečiště má zavedeny dva žilní katétry pro infusní výživu a odběry krve n Náhle se stav prudce zhoršil, objevily se vysoké horečky, které kolísají – ošetřující lékař vyslovil podezření na septický stav, odebírá krev na kultivaci (hemokulturu) n Po vyměnění katetru a antibiotické léčbě se stav opět zlepšil A kdo je vinen nyní? n Vinen je Staphylococcus epidermidis, nejběžnější z.takzvaných koaguláza negativních stafylokoků n Koaguláza negativní stafylokoky patří do stejného rodu jako zlatý stafylokok n Jsou mnohem méně patogenní než on n V poslední době jsou však velice významnými původci infekcí u oslabených osob, zejména nemocničních Proč říkáme koaguláza negativním stafylokokům koaguláza negativní? Dozvíte se za chvíli… Mohou být i hodné n Ne každý stafylokok je ovšem zločincem! n Koaguláza negativní stafylokoky jsou hlavní součástí běžné bakteriální mikroflóry na kůži. n Dokonce ani nález zlatého stafylokoka na kůži či v nosní dutině nemusí znamenat přímo nemoc. Mnozí lidé jej mají trvale n Leckdy je nález stafylokoka jen náhodný Jak vypátrat viníka? n Nejdříve si zopakujme kriminalistické metody, které jsme se naučili na jaře: n Přímé metody jsou mikroskopie, kultivace, biochemické identifikační metody, průkaz antigenu, průkaz DNA, pokus na zvířeti apod. n Přímé metody aplikujeme na vzorek (přímý průkaz ve vzorku) nebo na kmen (identifikace izolovaného kmene) n Nepřímé metody jsou ty, kterými prokazujeme protilátky Popis pachatele (diagnostika) n Mikroskopie: grampozitivní kok n Kultivace: na KA kolonie větší (2 mm), ploché, máslovité konzistence, bílé, anebo (hlavně u zlatého stafylokoka) nazlátlé n Biochemické testy: kataláza pozitivní, oxidáza negativní, biochemicky lze rozlišit jednotlivé druhy n Antigenní analýza a speciální testy mohou při pátrání velice pomoci Fotografie z databáze zločinců Odlišení od ostatních podezřelých (diferenciální diagnostika 1) n Gramovo barvení odhalí všechny bakterie, které nepatří mezi grampozitivní koky n Pozitivní kataláza odliší stafylokoky od streptokoků a enterokoků n Stejnou službu (a ve směsi mikrobů ještě lepší) udělá kultivace na KA s 10 % NaCl n Orientačně můžeme využít i toho, že kolonie ostatních G+ koků nejsou bílé či nazláté a že mikroskopicky netvoří shluky Rozlišení podezřelých stafylokoků (diferenciální diagnostika 2) n Volná plasmakoaguláza je pozitivní u zlatého stafylokoka, negativní u koaguláza negativních, proto se tak také jmenují n Clumping factor neboli vázaná plazmakoaguláza se používá stejně, ale je méně spolehlivá n Komerční testy na bázi antigenní analýzy jsou naopak velmi spolehlivé n Hyaluronidáza je nejen spolehlivá, ale i levná Méně spolehlivé testy: hodí se při pátrání, ale nejsou důkazem pro soud! n Hemolýza: Koaguláza negativní stafylokoky mohou produkovat jen delta hemolyzin, zlaté i alfa a beta, mívají proto mnohem výraznější hemolýzu n Nazlátlé zbarevní kolonií a jejich větší průměr může také napovědět n Větší shluky v mikroskopii jsou také typické pro zlaté stafylokoky Obávaný „zlatý“ to není: a co teď? n Ve většině případů se spokojíme s tím, že jde o koaguláza negativního stafylokoka a netrváme na druhovém určení n Pokud na druhovém určení trváme (např. u hemokultur), lze je provést biochemicky n V našich podmínkách se nejčastěji používá STAPHYtest 16 (Pliva-Lachema) A nyní se pusťme do pátrání! Přehled úkolů, které nás čekají: n Mikroskopie VZORKU sputa – úkol 1 n Mikrospopie předložených KMENŮ – úkol 2 Po druhém úkolu poznáme grampozitivní koky n Popis kolonií na krevním agaru – úkol 3 n Katalázový test – úkol 4 n Růst na KA s 10 % NaCl – úkol 5 Po těchto úkolech odlišíme stafylokoky od ostatních n Odlišení zlatého stafylokoka od koaguláza negativních druhů – úkoly 6a, 6b a 8 n Druhové určení stafylokoka – úkol 7 n Testování citlivosti na atb – úkol 9 Úkol 1: Pátráme po pachateli mikroskopicky ve vzorku n Prohlédněte si mikroskopický preparát sputa, obarvený podle Grama n Pátrejte po grampozitivních kocích ve shlucích a také po leukocytech (hlavně polymorfonukleárech), které svědčí pro bakteriální zánět Úkol 2: Defilé podezřelých (barvení kultur podle Grama) n Obarvěte podle Grama čtyři podezřelé kmeny (pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit, imerzní obj.) n Jednoho podezřelého vyloučíte snadno: bude to G- tyčinka. Další tři podezřelí budou G+ koky a spolehlivě je tedy mikroskopií nedokážete rozlišit… Musíte postupovat dál Úkol 3: Shromáždění otisků prstů – popis kolonií na KA n Pečlivě si prohlédněte zbylé tři kmeny grampozitivních koků. Prohlédněte si i kmen gramnegativní tyčinky, všimněte si, jak moc se od koků její kolonie liší n Popište všechny vlastnosti kolonií a zvlášť si všímejte těch vlastností, které odlišují stafylokoky od ostatních grampozitivních koků (výrazný pigment, konzistence) Úkoly 4 a 5: dopadení stafylokoka n V úkolu 4 odhalíme stafylokoka tím, že roste na KA s 10 % NaCl, kdežto ostatní nikoli n V úkolu 5 odhalíme stafylokoka katalázovým testem (kolonie vmícháme do kapky peroxidu vodíku). Pokud šumí, je to stafylokok Pozor! Kdybychom přeskočili předchozí kroky, udělali bychom špatně. Pozitivní katalázu má spousta bakterií. Relativně průkazná je jen tehdy, víme-li, že náš kmen je G+ kok Je to stafylokok. Ale který? Úkoly 6a, 6b a 8: odlišení „zlatého“ n Úkol 6 a) – clumping factor neboli vázaná plasmakoaguláza (zůstává součástí těla mikroorganismu) n Úkol 6 b) – volná (plasma)koaguláza (říká se jí „volná“, protože je to molekula enzymu, enzymem uvolňovaná do prostředí) n Komerční testy provádět nebudeme n Úkol 8 – hyaluronidáza (dekapsulace) 6 a): Clumping factor neboli také vázaná plasmakoaguláza – rychlé n Kolonie se vmíchají do kapky králičí plasmy na podložním sklíčku n Nejde vlastně o KOAGULACI, ale o AGLUTINACI plasmy n Test není příliš spolehlivý 6 b): Volná koaguláza – klasika n Nejklasičtější z testů pro odlišení zlatého stafylokoka (koaguláza pozitivního stafylokoka) n Kličkou nabrané kolonie vmícháme do králičí plasmy ve zkumavce n Pokud plasma zkoaguluje (má konzistenci želé), je koaguláza pozitivní Komerční testy, např. Staphaurex (v praktiku je neprovádíme) n Provedením připomínají clumping factor, ale jsou spolehlivější než volná plasmakoaguláza n Jsou bohužel poměrně drahé 8: Hyaluronidáza (test dekapsulace) (Úkol 7 zatím přeskočíme) n Elegantní test, jehož principem je skutečnost, že hyaluronidáza, produkovaná zlatým stafylokokem (ne však koaguláza negativními stafylokoky) rozpouští pouzdro (kapsulu) opouzdřených bakterií. Používá se druh streptokoka Streptococcus equii, pro člověka nepatogenní n Ztráta pouzdra se projeví změnou vzhledu streptokoka (ztráta „hlenovitosti“) Co tedy musíme prakticky provést n V úkolu 6 a) provedete clumping faktorový test, když kolonie vmícháte do kapky plasmy n V úkolu 6 b) si prohlédneme výsledek testu plasmakoagulázy, který byl připraven včera. Odečítá se orientačně po 4 h a spolehlivě až po 24 h. Pozitivní je koagulovaná tekutina. n V úkolu 8 si prohlédneme včera připravený hyaluronidasový test. Pozitivní je kmen, který „rozpouští slizovitost“ pásu stafylokoka Úkol 7: rozlišení stafylokoků n V úkolu 7 provedete STAPHYtest 16 podle návodu, čímž jednak ověříte identitu zlatého stafylokoka a jednak určíte toho druhého n Za normálních okolností zlaté stafylokoky STHAPHYtestem neurčujeme, stačí nám testy z úkolů 6a, 6b a 8, popřípadě komerční testy n Test tedy slouží k diagnostice koaguláza negativních stafylokoků Vám se ovšem žíly jistě nezkrátí, když si ověříte tímto testem i identifikaci zlatého stafylokoka STAPHYtest 16 – jak ho odečíst n Pozor – i když se jmenuje STAPHYtest 16, zahrnuje ve skutečnosti 17 reakcí. Jako první se odečítá test VPT ve zkumavce. Červená terutitna ve zkumavce = pozitivní VPT, bezbarvá tekutina = neg. n První řádek STAPHYtestu = 2. – 9. reakce n Druhý řádek STAPHYtestu = 10. – 17. rce n Vypočítejte kód a porovnejte s kódovníkem n Kód je šestimístný. Prvních pět číslic je ze trojic testů, šestá číslice je z dvojice Výsledek – první kmen (703 651 = S. aureus, 99,8 %, T[in]=1,00) Výsledek – druhý kmen (703 241 = S. epidermidis, 97,95 %, T[in]=1,00) Api Staph – zahraniční obdoba našich STAPHYtestů 16 Léčba: spravedlivý trest zločinci n Zločinné stafylokoky potrestáme vhodným antibiotikem. U stafylokoků je lékem volby oxacilin, u močových infekcí cefalosporiny první generace. Oblíbené makrolidy jsou na místě jen u alergických osob, linkosamidy mají význam u infekcí pohybové soustavy a aminoglykosidy raději jen v kombinaci. Glykopeptidová antibiotika (vankomycin a teikoplanin) jsou v rezervě. Používají se u kmenů rezistetntních na oxacilin, takzvaných MRSA a MRSKN Obvyklé pravidlo: horší patogen – lepší citlivost n Při plnění devátého úkolu si možná všimnete, že horší patogen (zlatý stafylokok) je zpravidla citlivější než mírnější patogen (koaguláza negativní stafylokok). Toto pravidlo je logické: menší patogenita je znakem adaptace, schopnosti mikroba koexistovat s námi a nevyvolávat u člověka chorobný stav. `a přivyknutí mimo jiné i antibiotikům, která používáme. n Neplatí ovšem vždycky! Jsou výborně citlivé kmeny S. epidermidis, a jsou kmeny MRSA. MRSA a jejich detekce n Meticilin rezistentní stafylokoky (MRSA) jsou epidemiologicky závažné kmeny, často způsobující nozokomiální infekce n Příčinou je změna tzv. penicinin binding proteins (PBP) n Na problém upozorní malá zóna u oxacilinu. Ta však může být způsobena i jinými vlivy n Za průkazné se považuje, je-li malá zóna nejen u oxacilinu, ale i u cefoxitinu Úkol 9: účinnost uloženého trestu (V protokolu chyba tisku – „úkol 8“) n Odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a porovnejte s referenčními zónami n Máte k dispozici DVA sety: S1 (základní set) a S2 (rozšířený) n Každý set je proveden na kmen STKN (koaguláza negativního stafylokka) a STAU (zlatého stafylokoka. n Na set S2 nemáte v protokolu tabulku – pište prosím z druhé strany listu Prosíme, neopisujte! n Každý půlstůl (označeno A až H) má jiné kmeny S. epidermidis (STKN) a S. aureus (STAU), proto každému vyjde jiná citlivost. Správné citlivosti pro každý půlstůl máme napsané. Při kontrole protokolů budou uznány pouze výsledky odpovídající vašemu půlstolu n Dva půlstoly mají STAU = MRSA – v tom případě neplatí pravidlo, že koaguláza negativní stafylokok by měl být citlivější. Odečtení testu citlivosti: S1 (základní test) Odečtení testu citlivosti: S2 (rozšířený test) Pro zvídavé: něco o mikrokocích n Mikrokoky se dlouho považovaly za blízké příbuzné stafylokoků. Nyní se však soudí, že příbuzné nejsou. n Jsou to rovněž grampozitivní koky v malých shlucích, jsou však oxidáza pozitivní n Dřívější rod Micrococcus se rozpadl do rodů Micrococcus, Kytococcus, Kocuria, Nesterenkonia a dalších. Kocuria se jmenuje pro prof. Kocurovi, brněnském mikrobiologovi Mikrokoky mají krásné pigmenty n Micrococcus luteus je sírově žlutý (ne zlatý jako Staphylococcus aureus), Kocuria rosea je růžová n V klinickomikrobiologické laboratoři je nacházíme jako kontaminaci. Nashledanou při dalším dílu!