Než doopravdy začneme: n Zapalte si kahany. Každý půlstůl si vezme jedno podložní sklíčko a kápne na něj MALOU kapku fyziologického roztoku. Na každém stole obarvěte oba kmeny. n Udělejte POUZE TOTO, nepokračujte v.barvení – to budeme dělat až po výkladu! NA STOPĚ PACHATELE Díl pátý: Gramnegativní zločinci II Mikrobiologický ústav uvádí Opět začneme testíkem… n Které jsou klinicky významné G+ koky? Stafylokoky, streptokoky, enterokoky n A které klinicky významné G+ tyčinky? Např. listerie, koryneformní tyčinky, bacily n A co obligátně patogenní enterobakterie? Yersinie (hlavně Y. p.), shigely, salmonely (AP!) n A nějaké potenciálně patogenní? Escherichie, klebsiely, enterobaktery, serracie, protey, providencie, morganely, citrobaktery… Testík pokračuje… n Je rozdíl mezi enterokokem a enterobakterií? Setsakramentský! Enterokok je G + kok, enterobakterie, včetně rodu Enterobacter, jsou gramnegativní tyčinky. Ovšem, všechny mají nějaký vztah ke střevu obratlovců (stejně jako enteroviry) n Které bakterie rostou na Endově půdě? Enterobakterie, Vibrionaceae, G- nefermentující n Jak je vzájemně rozlišíme? Nefermentující nefermentují glukózu, vibria jsou OX + n Jak poznáme fermentaci glukózy? Například půda dle Hajny při kultivaci nefermentujících zůstane červená. (Existují i různé další testy.) A testík ještě pokračuje… n V čem všem je užitečná Endova půda? Jednak na ní rostou jen NĚKTERÉ G- tyčinky, jednak rozliší L+ a L- bakterie, což je zejména při diagnostice enterobakterií velká výhoda. n Které půdy se používají v dg. enterobakterií? CIN (yersinie), XLD, MAL aj. (salmonely) n Co udělat, když půdy nestačí? Biochemické určení (u nás např. Enterotest 16) n Jak odlišíme EPEC? A jak S. Enteritidis? V obou případech antigenní analýzou na skle Na začátek motto… Bylo nevlídno, že by PSAE ven nevyhnal… (PSAE – zkratka pro Pseudomonas aeruginosa) Příběh první n Kubík je hodný kluk, ale jeho rodiče jsou členy jakési sekty a nechtějí Kubíka nechat očkovat. Nejraději by ho měli pořád doma, ale nakonec ho přece dali do školky… n Po měsíci ve školce začal být Kubík nachlazený, smrkal, kašlal, a nakonec se začal dusit a sípavě dýchat. Volali RZP, ukázalo se, že Kubík má zánět příklopky hrtanové – nemoc, která se dnes už moc často nevidí… Kdo to Kubíkovi udělal? n Viník: Haemophilus influenzae serotyp b (Hib) n Hemofily jsou krátké gramnegativní tyčinky. Nerostou na Endu, ale dokonce ani na KA n Ze všech hemofilů je nejhorší H. influenzae. Ze všech kmenů H. influenzae jsou nejhorší kmeny opouzdřené. A ze všech opouzdřených pak ty, které vlastní pouzderný typ b n Způsobují epiglotitidy, meningitidy a sepse. Ale zároveň hemofily (zvlášť ty, které nepatří mezi „Hib“) jsou úplně běžně nalézány v krcích. Čeleď Pasterurellaceae: Pasteurely a hemofily n Pasteurella multocida je běžnou flórou v psích tlamách. U člověka způsobuje zejména zhnisání ran po pokousání psem či jiným zvířetem. Má podobný charakteristický pach jako hemofil, ale na rozdíl od něj roste na krevním agaru. Vypadá tam jako něco mezi streptokokem a enterokokem, ale je rezistentní na vankomycin, což obvykle mikrobiologa „trkne“. n Nejznámější hemofily jsou H. influenzae (druhové jméno? Často sekundární infekce při „chřipkovitých“ virózách), H. parainfluenzae a H. aphrophilus. Původcem měkkého vředu je H. ducreyi. Příběh druhý n Pan Zápalka je pyroman. Nedávno na svou vášeň doplatil a nehezky se popálil. Nyní se mu popálenina zanítila. Leží na popáleninovém centru a je na tom velice špatně. Lékaři naštěstí pochopili, že běžná antibiotika jsou mu platná jako mrtvému zimník a provedli stěr. Díky tomu se podařilo najít cílenou terapii a pana Zápalku vyléčit – do doby, než zase něco zapálí a způsobí si další popáleniny. Kdo za to tentokrát může? U oslabených osob mohou způsobovat např. i zánět nehtového lůžka. Jak se naučit některé názvy n Zatímco některé bakteriální názvy se i chytrý student musí naučit zpaměti, u některých si bystrouš může pomoci. n Například Burkholderia cepacia způsobuje hnilobu cibule (Alium cepa), je to tedy opravdu klasický rostlinný patogen n Stenotrophomonas maltophilia je zase vlastně zúžené-výživy-jednotka maltózu-milující, tedy taková panda mezi mikroby, která místo bambusu okusuje maltózu. Toho logického je tu i víc! n Jak víte, klinicky významné bakterie používají zpravidla jeden ze dvou typů metabolismu: fermentaci a aerobní respiraci. n Escherichia coli, která má dost živin, ale málo kyslíku (i když jiných plynů si užije dost J) preferuje fermentaci glukózy i jiných cukrů. n Naopak pseudomonády mají kyslíku habaděj, ale živin málo. Volí tedy aerobní respiraci, která jim umožní to málo dostupných živin využít úplně n Adaptace na vnější prostředí se projevuje i pigmenty. Přehled lékařsky významných G - tyček Přehled metod použitelných k dopadení dnes probíraných zločinců n Přímé metody n Mikroskopie – pokud ji potřebujeme pro odlišení od bakterií jiné morfologie n Kultivace – nefermentující rostou na většině půd, Pasterurellaceae jsou mnohem vybíravější n Biochemická identifikace – u obou skupin; u nefermentujících je založena na reakcích aerobní respirace, vyžaduje e teplotu a 2 dny kultivace n Antigenní analýza – zejména u hemofilů (Hib) Nepřímé metody se téměř nepoužívají Fotografie z databáze zločinců 1: Hemofily Fotografie z databáze zločinců 2 Pseudomonas aeruginosa Odlišení od ostatních podezřelých (diferenciální diagnostika) n Gramovo barvení odliší gramnegativní tyčinky od ostatních bakterií n Endova půda: jak již víme, rostou na ní z.klinicky významných jen enterobaktérie, příslušníci čeledi Vibrionaceae a gramnegativní nefermentující tyčinky n Nefermentující odliší to, že nefermentují glukózu (např. Hajnova půjda zůstává po kultivaci celá červená, nezmění vůbec barvu) n Pasteurellaceae mimo jiné prozradí zápach K diagnostice hemofilů a pasteurel n Pasteurely rostou na krevním agaru n Hemofily na krevním agaru růst neumějí, protože si neumějí „otevřít“ krvinku n Rostou tedy na čokoládovém agaru n Na KA rostou v přítomnosti takové bakterie, která jim krvinku „otevře“ (satelitový fenomén). Takovou bakterií je například zlatý stafylokok n Mají droboučké kolonie, proto se používá disk k.odclonění ostatních bakterií (bacitracin, ale ve vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu) K diagnostice nefermentujících n Pseudomonády se zpravidla poznají: n Mají typickou vůni (mladé kultury) n Tvoří pigmenty, nejčastěji zelené, někdy modré či rezavé. Nejlépe jsou viditelné na MH, ale trochu i na KA či Endově agaru n Mají pozitivní oxidázu n Ostatní nefermentující, případně sporné pseudomonády, musíme rozlišit biochemicky, například NEFERMtestem 24 Úkol 1: Defilé podezřelých (barvení kultur podle Grama) n Obarvěte podle Grama čtyři podezřelé kmeny (pro zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem, poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda, safranin 60 s, voda, osušit, imerzní obj.) n Rozlišíte bakterie podle tvaru a typu buněčné stěny. Pro vzájemné G- tyčinek musíte pokračovat dál. Úkol 2 Kultivace hemofilů Úkol 3 Růstové faktory hemofilů n Prohlédněte si výsledky kultivace hemofilů na čokoládovém a krevním agaru a popište morfologii kolonií. Všimněte si, že na krevním agaru roste hemofil pouze v okolí stafylokoka (satelitový fenomén) n Ne všechny hemofily potřebují stejné faktory. H. parainfluenzae potřebuje faktor V (což je NAD), H. aphrophilus faktor X (což je hemin), H. influenzae potřebuje oba. Používáme disky napuštěné těmito faktory. Test růstových faktorů hemofilů Už mne nebudete potřebovat! Vypnuli jste mne, očistili a zakryli? Úkol 4 – antigenní analýza n Antigenní analýza se u hemofilů provádí obdobným způsobem jako u jiných bakterií. Dnes jsou zpravidla k dispozici komerční soupravy, obsahující např. i latexové částice a další součásti n Dříve se využívalo jevu tzv. koaglutinace se stafylokokem, kdy aglutinát byl hustší díky navázání stafylokoka na Fc konec protilátky proti hemofilovi n Prohlédněte si video Úkol 5 – testy antibiotické citlivosti n Hemofily nerostou na MH agaru n Zpravidla se používá Levinthalův agar (přefiltrovaný čokoládový agar), na kterém jsou zóny lépe viditelné než na klasickém čokoládovém agaru n V naší laboratoři se používá „hemofilový agar“, což je půda blízká agaru Levinthalovu n Případnou diskovou rezistenci k ampicilinu je třeba ověřit testem produkce betalaktamázy Upozornění n Hemofily tvoří velmi mrňavé kolonie. Pokud je očkujeme nahusto (jako při testování citlivosti na antibiotika), jsou ještě mrňavější. n Proto je na agaru není moc vidět. Je třeba najít vhodné úhly mezi vaším okem, miskou s hemofilem a dopadajícím světlem – zprvu se zdá, že tam nic není! Tabulka zón citlivosti – HEM Úkoly 6 a b c d: Dg. pseudomonád n V úkolu 6 a) c) d) provedete testy sloužící k.diagnostice pseudomonád, dle protokolu n 6 a Popište kolonie na KA, Endově agaru a MH. Nezapomeňte je očichat. Při přirovnávání se fantazii meze nekladou (jasmín? jahody? plastelína?) n 6 c Zaznamenejte růst na půdě dle Hajny n 6 d Proveďte oxidázový test n V úkolu 6 b) si ozřejmíte, že pseudomonáda je striktně aerobní bakterie, nikoli fakultativně anaerobní jako například Escherichia coli Úkol 7 – testy antibiotické citlivosti n Na rozdíl od hemofilů rostou pseudomonády na nejrůznějších půdách včetně MH n Bude se vám možná znát, že „přece ty pseudomonády nejsou tak hrozně rezistentní, jak nám ti hloupí asistenti říkají“. Jenže – citlivé jsou tehdy, když použijeme sestavu speciálních protipseudomonádových antibiotik, a i to jenom někdy. n Všimněte si, že pseudomonáda díky tvorbě pigmentu zpravidla barví MH agar na zeleno Tabulka zón citlivosti – PS 1 Tabulka zón citlivosti – PS 2 Šlo by to i E-testem …pláště laskavě nepohazujte po praktikárně, nýbrž je pověste na věšák tak, aby nespadly. Nashledanou při dalším dílu!