NA STOPĚ PACHATELE Díl osmý: Acidorezistentní pachatelé Mikrobiologický ústav uvádí Opět začneme testíkem… n Jaké je složení G+ buněčné stěny? Peptidoglykan (murein), řetěžce kys. teichoové n Jaké je složení G- buněčné stěny? Tenká vrstva mureinu, nad ní vnější membrána n Které bakterie se nebarvní podle Grama? Ty, které nemají buněčnou stěnu, nebo ji mají hodně jinou než ostatní n Jaké bakterie jsme viděli ve vzorcích sputa? G+ koky ve shlucích a řetízcích, G- tyčinky Testík pokračuje… a končí n Jaké znáte způsoby získání anaerobiózy? Mechanický ve VL bujónech, fyzikální u anaerobních boxů, chemický u anaerostatů n Které anaerobní mikroby se snadno přenášejí z člověka či prostředí na člověka? Klostridia, protože tvoří spory n U kterých anaerobů se užívá pokusná myš? U Clostridium tetani a Clostridium botulinum n Který toxin se prokazuje na žloutk. agaru? Lecitináza Clostridium perfringens Úvod: Plivátka v boji proti TBC V době první republiky vyvinula společnost za osobní angažovanosti prezidenta Masaryka a jeho „Ligy proti tuberkulóze“ velké úsilí v boji proti této nemoci. Významnou součástí byla osvěta, aby lidé neplivali na zem, ale používali plivátka. Příběh první n Honza již několik let věděl, že je HIV pozitivní. Dobře věděl, že je mnohem zranitelnější než ostatní lidé, že ho každá infekce dostihne rychleji než jiné n Přesto ho zaskočilo, že v.poslední době začal kašlat. Jeho ošetřující lékaři zkoušeli různé možnosti, až nakonec na základě rentgenu, PCR vyšetření a kultivačního vyšetření dospěli k.názoru, že se jedná o miliární (zrnkovitou) formu tuberkulózy. Viníkem zde bylo n Mycobacterium tuberculosis, i když TBC může zůpsobovat i například Mycobacterium bovis. n Zajímavostí tohoto mikroba je záliba v životě uvnitř buněk. S tím také souvisí skutečnost, že na mykobakteria se špatně tvoří protilátková odbpověď (takže se nedá prokazovat antigen ani protiláky) a že hlavní slovo má buněčná imunita – i při vakcinaci. n Jelikož při HIV infekci je právě buněčná imunita postižena, je TBC jednou z oportunních infekcí. Tuberkulóza Není jen plicní forma TBC TBC ve světě Ještě jednou TBC Další zvláštnosti mykobakterií Buněčná stěna mykobakterií Příběh druhý n Pan Hassan žil v pouštní části Súdánu, zmítané neustálými válkami a nepokoji. n V poslední době se od něj začali odvracet i ti přátelé, kteří ještě neuprchli ani nebyli povražděni. Znetvoření obličeje pana Hassana bylo neklamnou známkou, že pan Hassan trpí onemocněním, které se v těchto zeměpisných šířkách ještě stále vyskytuje až příliš často. n Naštěstí se pan Hassan setkal s pracovníky jedné nevládní organizace, kterým rovněž byla diagnóza jasná. Pomocí dapsonu se podařilo panu Hassanovi pomoci. Lepra Viníkem je Jiná mykobakteria n Kromě M. tuberculosis a M. leprae existuje i spousta dalších mykobakterií. Některá, např. Mycobacterium marinum, patří mezi tzv. atypická mykobakteria, která občas způsbobují infekce ran a jiné problémy. Některá mykobakteria jsou nepatogenní a jsou normální součástí lidské mikroflóry, např. M. smegmatis – viz obrázek Příběh třetí n Paní Píštělková si už delší dobu hmatala pod kůží krku drobné útvary n Nedávno se stalo, že jeden z těchto útvarů se otevřel na povrch a v ústí se objevil velmi hustý, žlutý páchnoucí hnis. To už paní Píštělkovou donutilo zajít k lékaři. n Lékaři poslali hnis na mikrobiologické vyšetření. Vyšetření trvalo dlouho – paní Píštělková už spílala mikrobiologům, že si tam někde válejí šunky. Nakonec se ukázalo, že… …jde o aktinomykózu Nokardióza mozku na CT Acidorezistence a alkalirezistence Co z toho vyplývá pro klinika? Defilé zločinců: Mycobacterium tuberculosis Jak pátrat mykobakteriích n Mikroskopie: Používá se Ziehl-Neelsenovo barvení n Kultivace: Používá se speciálních půd, přičemž před vlastní kultivací předchází moření, obvykle louhem. Cílem moření je usmrtit ostatní bakterie, které by při svém rychlém růstu byly kultivačně úspěšnější. Alkalirezistentní mykobakteria moření ruče přežijí. n Automatická kultivace: Používá se různých typů kultivačních automatů: mohou detekovat kultivační pozitivitu mnohem dříve než klasická kultivace n Biochemické rozlišení je možné, je však vyhrazeno specializovaným laboratořím n Pokus na zvířeti: občas se používá morče n PCR diagnostika se stává čím dál důležitější PCR kit pro diagnostiku TBC Úkol 1: Barvení dle Ziehl-Neelsena Úkol 2: Prohlédnutí preparátů n V prvním kroku barvíme karbolfuchsinem (Gabbetem) za horka až do výstupu par. Bez zahřívání by mykobakteria vůbec nešlo obarvit. n V druhém kroku odbarvujeme „kyselým alkoholem“, což je směs alkoholu s minerální kyselinou, nejčastěji kyselinou chlorovodíkovou n Ve třetím kroku dobarvujeme pozadí, tj. vše, co jsme ve druhém kroku odbarvili. Dobarvujeme malachitovou zelení nebo metylenovou modří. n Výsledkem jsou červené acidorezistentní tyčinky na modrém nebo zeleném pozadí Ziehl-Neelsenovo barvení Úkol 3: Kultivace mykobakterií n Před kultivací musí být provedeno moření n Používáme tekutou půdu Šulovu či Baničovu a vaječné půdy Ogawovu či Löwenstein-Jenssenovu. Vaječné půdy jsou tuhlé vzhledem ke koagulaci vaječného bílku – neobsahují agar n I pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají zátkou. Není to jen kvůli ohrožení personálu, ale především kvůli vyschnutí půdy. n Výsledky se odečítají po 3, 6 a pro jistotu i 9 týdnech kultivace. Vzhled kolonií mykobakterií Úkol 4 – testy antituberkulotické citlivosti (nikoli antibiotické!) n Nelze používat difúzní diskové testy n Antituberkulotika přidáváme přímo do kultivační půdy n Antituberkulotika jsou zvláštní látky, až na výjimky odlišné od antibiotik n Vždy se užívají kombinace tří či čtyř: rychle totiž vznikají rezistence, navíc některá působí jen intra- a jiná zase extracelulárně Přehled běžně užívaných antituberkulotik Úkoly 5 a 6 – mikroskopie a kultivace nokardií n V úkolu 5 popište preparáty barvené podle Grama n V úkolu 6 popište kolonie na KA a krevním VL agaru. Všimněte si, které bakterie rostou za aerobních podmínek a které za anaerobních Úkol 7 – testy antibiotické citlivosti n Antibiotická citlivost se na rozdíl od mykobakterií dá u nokardií a aktinomycet stanovit difusním diskovým testem. Musíme ale počítat s tím, že rostou pomalu a špatně. Tabulka zón citlivosti – doplnit!!! Nashledanou při dalším dílu!