SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY Hana Konečná CENTRÁLNÍ LABORATOŘ Masarykovy Univerzity v Brně Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta Masarykovy university ODDĚLENÍ FUNKČNÍ GENOMIKY A PROTEOMIKY Laboratoř analýzy biologicky významných komplexů Centrální laboratoř CL Laboratoř molekulární fyziologie rostlin CENTRÁLNÍ LABORATOŘ ˇ přístup k pokročilým technologiím na bázi sdílené instrumentace a její kvalifikované obsluhy proteomické techniky genomické techniky ˇ výuka - přednášky a praktické kurzy ˇ členství v ABRF (Association of Biomolecular Resource Facilities) TECHNIKY V CENTRÁLNÍ LABORATOŘI ˇ sekvenování a fragmentační analýza DNA ˇ syntéza a purifikace oligonukleotidů ˇ kapalinová chromatografie ˇ gelová elektroforéza ˇ analýza obrazu ˇ digesce proteinů ˇ hmotnostní spektrometrie ˇ minisklad reagencií pro molekulární biologii SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY ˇ definice ˇ aplikace ˇ modifikace ˇ syntéza ˇ purifikace ˇ kontrola kvality ˇ design sekvence ˇ zásady navrhování ˇ software OLIGO 6 ˇ praktická ukázka oligonukleotid ˇ krátká jednořetězcová struktura ˇ DNA nebo RNA (event. PNA) ˇ hydroxyl na obou koncích oligonukleotid syntetický oligonukleotid primer Aplikace syntetických oligonukleotidů ˇ konstrukce duplexů ˇ primery pro syntézu komplementární DNA PCR, Real-Time PCR ˇ hybridizační sondy pro klonování ˇ místně cílená mutageneza ˇ strukturální rentgenová analýza NA ˇ NMR studia interakcí DNA-protein ˇ potenciální léčiva ˇ gene arrays Modifikace ˇ degenerace ˇ konce řetězce ˇ báze ˇ fosfát ˇ cukr ˇ PNA Degenerované oligonukleotidy M A or C R A or G W A or T S C or G Y C or T K G or T V A or C or G H A or C or T D A or G or T B C or G or T N G or A or T or C X G or A or T or C 2-deoxyinosin ? univerzální báze: 3-nitropyrrol ? 5-nitroindol ? www.glenres.com Modifikace na 5´- konci sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR postsyntetické modifikace Modifikace na 3´- konci derivatizovaná matrice Real-Time PCR ˇ 2x značená sonda ˇ REPORTER ˇ QUENCHER Další modifikace páteř cukr Terapeutika nedegradována nukleázami! modifikace fosfodiesterové vazby ANTISENSE oligonukleotid ˇ oligonukleotid nebo analog ˇ komplementární k segmentu RNA nebo DNA ˇ vazbou inhibuje jejich normální funkci Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin N-terminal C-terminal 5´-end 3´-end PNA DNA ˇ nenabitá molekula ˇ vazba k DNA/RNA PNA Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin N-terminal C-terminal 5´-end 3´-end PNA DNA ˇ nenabitá molekula ˇ vazba k DNA/RNA PNA Vlastnosti PNA Locked Nucleic Acid 2'-O, 4'-C methylenový můstek potlačená flexibilita ribofuranózového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjímečná biostabilita LNA T-LNAdmf-G-LNA5-Me-Bz-C-LNABz-A-LNA Syntéza oligonukleotidu ˇ organická syntéza na pevné fázi ˇ od 3´-konce k 5´-konci ˇ bezvodé prostředí OLIGONUKLEOTIDY design syntéza purifikace EXPEDITE 8909 Kontrola kvality ˇ anex ˇ RP HPLC Perfúzní chromatografie Perfúzní chromatografie POROS klasický sorbent POROS Maldi-Tof MS CE PAGE Sephadex RP cartridge HPLC PURIFIKACE Odsolování ˇ soli ˇ oligonukleotid http://www.sci.muni.cz/FGP DESIGN OLIGONUKLEOTIDU ˇ manuální ˇ počítačový HLAVNÍ ZÁSADY NAVRHOVÁNÍ SEKVENCE ˇ vysoce specifické ˇ netvoří dimery a hairpins ˇ stabilní duplexy s aktivní sekvencí ˇ nepříliš stabilní 3´-konec http://bip.weizmann.ac.il/bio_tools/primers.html 5´ 3´ 5´3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + PRIMING EFFICIENCY 360 velmi vysoká 340 vysoká 320 střední 310 uspokojivá 300 nízká 290 velmi nízká DUPLEX ˇ DIMER intermolekulární ˇ HAIRPIN intramolekulární PRAKTICKÁ ÚLOHA Consensus primer ˇ CODEHOP Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide ˇ pro rozdílné proteinové sekvence vyžadující degenerované primery ˇ CORE 3´- oblast 11 ­ 12 bp degenerovaná ˇ CLAMP 5´- oblast nedegenerovaná, délka dle požadované annealing teploty, obvykle 20 ­ 30bp ˇ specifický během časných cyklů ˇ selektivní v pozdních cyklech http://blocks.fhcrc.org/codehop.html OBJEDNÁVKY www.sci.muni.cz/FGP ˇ on-line ˇ e-mail ˇ písemně