Bnovíi ísľsjpjs MUDr. Julie Bienertová Vašků 8.12. 2006 M Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta. Ü Do buněk se transferují: geny nebo jejich části nebo oligonukleotidv. R Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta ■ In vitro: genové modifikace probíhají mimo organismus ■ Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do organismu \K c* f ■ 1. Léčba a zlepšování kvality života a. dědičná i získaná onemocnění b. malignity c. AIDS/HIV Dobrá zpráva: Obrovské pokroky v rekombinantní DNJ4 technologii během uplynulých 2 dekád, parciální úspěchy| léčbě SCID Spatná zpráva: Účinnost užívaných protokolů pro gen| terapii je diskutabilní, technické obtíže s transferovými vektory nedostatečné pochopení biologických interakcí vektorem a pacientem (případ Jesseho Gelsingera ■ Klasická genetická terapie ■ Je potřeba dopravit geny do vhodných cílových buněk, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů s cílem: ■ 1. zajistit produkci látky, která chybí ■ 2. aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky ■ Neklasická genová terapie inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese í Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací. Etické problémy s potenciálni terapií zárodečných mutací. Nosiče genetické ir Virové RETROVIRY I • ADENOVIRY/ ADENO ASSOCIATED VIRUS ■ • HERPES VIRY I • LENTIVIRY I • JINÉ NEVIROVÉ I «RECEPTOROVE ZPROSTŘEDKOVANÉ ■ «LIPOZOMY ■ • PŘÍMÁ INJEKCE \K t m Typ 1: single gene onemocnění (monogenní), 100% herj příklady: Srpkovitá anémie Hypercholesterolémie Cystická fibróza Typ 2: multifaktoriální onemocnění, heritabilita není Jsou závislé na enviromentálních faktorech a životním s| příklady: Ischemická choroba srdeční Nádorová onemocněné Diabetes Alkoholismus Schizofrénie I Rekombinantní proteiny a „genetically engineered" vakcíny I Expresní klonování - produkty normálního genu (klonované geny) jsou exprimovány v mikroorganismech nebo u transgenních zvířat, které slouží k tvorbě velkých množství medicínsky cenných produktů I Geneticky vytvářené „engineered" protilátky- (geny pro protilátky jsou manipulovány k tvorbě nových částečně nebo plně humanizovaných protilátek) pro terapeutické použití £ Geneticky vytvářené vakcíny -především proti tumorům a infekčním agens. 22.1 Principles or molecular genetic-based therapies ani treatment Cells killed by expressed toxin Ceils killed by drug Foreign antigen gene Cytokine gene Assisted killing of disease cells by immune system cells Disease cells CM Disease cells or Nondisease ceUsr especially immune system cells V t t / \ t t / o o o o © © ©r o^ o po / J í \ i™ J t™] i™ i s. c it : Killing of disease cells because of enhanced immune response Targeted inhibition of gene exprc Antisense gene or Antisense 0DN.TF0, etc, Disease cells containing mutant or harmful m gene rj-j oc wAAAA n 1 íssion Block expression gene Targeted gene mutation correction GeneX aaHaa XX aaBaa öd\ /[Ei hu Disease cells (mutant gene X) Corrected gene (genetic mutation corrected to restore functional gene) 39994699 Uměle produkované terapeutické protilátky jsou navrženy jako monospecifické (poznají jen jeden typ antigenního místa) a poznají specifické antigény asociované s nemocí, což vede k zabití nemocných buněk I Typy nemocí: M Lymfomy, leukémie, infekční nemoci, autoimunitní nemoci. ■ Hybridomy = heterogenní směs hybridních buněk (vzniklých fúzí), které jsou schopny produkovat specifické protilátky (B lymfocyty imunizovaného zvířete) a přitom se v kultuře neomezeně dělit (nesmrtelný myší B-lymfocytární tumor). hlodavci M Humanizace hlodavcích mAb umožňuje získat velké množství protilátek a zároveň zabránit imunitní odpovědi lidského příjemce: ü chimérické V/C protilátky Ü CDR (complementarity determining regions) graft protilátky ■ Infekční patogeny a antigény nádorových buněk CDR All-rodent antibody Humanized antibody Genetically engineered antibodies. CDR VCDR Chimeric (V/C) antibody CDR Fully human antibody Table 22.2: Examples of the clinical potential of humanized antibodies Target Clinical potential CDw52 Lymphomas, systemic vasculitis, rheumatoid arthritis CD3 Organ transplantation CD4 Organ transplants, rheumatoid arthritis, Crohn's disease IL-2 receptor Leukemias and lymphomas, organ transplants, graft-versus-host diseas« TNF-ot Septic shock HIV AIDS RSV Respiratory syncytial virus infection HSV Neonatal, ocular and genital herpes infection Lewis-Y Cancer p185HER2 Cancer PLAP Cancer CEA Cancer Technologie fágového displaye: protilátky jsou tvořeny in vitro napodobováním selekční strategie imunitního systému M Transgenní myši: Transfer kvasinkových umělých chromozomů s velkými segmenty lidských těžkých a lehkých Ig řetězců do myších embryonálních buněk. Narozené myši obsahují velmi pozoruhodnou porci lidských V genetických segmentů a jsou schopny tvořit lidské protilátky I Pomocí rekombinantní technologie: K Vakcíny nukleových kyselin: í bakteriální plasmidy s geny pro patogeny nebo tumorové antigény, podávané i.m. v solném roztoku. Obsahují silný virový promotor. ■t „gene gun" - zlaté perly, do nichž byla precipitována DNA M Genetická modifikace antigénu - např. fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení antigenicity t Genetická modifikace virů- virové vektory íl Genetické modifikace mikroorganismů, které způsobí: i odstranění genů nutných pro patogenezu I expresi exogenního genu v bakteriích nebo parazitech po jeho inzerci do těchto organismů ■ Geny mohou inzertovany do buněk pacienta přímo a nepřímo ■ Inzertovane geny se mohou integrovat intrachromozomálně extrachromozomálně Metody k zacílení nepostižených buněk: ■ Buněčné zabíjení, způsobené imunitním systémem- jde o podporu imunitní odpovědi namířené proti nádorovým buňkám nebo infekčním agens M Uvolnění genetických produktů z buněk na vzdáleném místě (myoblasty sekretují do krve) ■ In vivo I Transfer se děje přímo do tkáně pacienta. Pomocí liposomů neboj virových vektorů. ü Ex vivo I Transfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk) Fiqure 22-3: In vivo and ex vivo gene therapy. Cloned gene X r\j" j\ Select X+ cells; amplify Return genetically modified cells to patient X+ cells I cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce genu se děje M A) do chromozomu I gen se bude rozšiřovat do dalších buněk I zajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky) í náhodná inzerce-různá lokalizace -různá úroveň exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo. ■ B) extrachromozomálně - nevýhoda nejistého dlouhodobého účinku Exogenous genes that integrate into chromosomes can be stably transmitted to ail daughter cells, unlike I I Virové vektory Onkoretrovirové - viry s reverzně transkriptazovou funkcí, schopné syntetizovat cDNA. Adenovirové - mají přirozený tropismus k respiračnímu epitelu Adeno-asoc/ované-neobsahují virové geny-bezpečné Herpes simplex - tropické pro C N S Lentivirové - komplexní retroviry (HIV), které napadají makrofágy a lymfocyty. Schopné transdukce do nedělících se buněk______________ Binding to receptor Endosome Plasma membrane Vesicle disruption A Nuclear envelope * Migration % into nucleus i # Adenoviruses enter cells by receptor-mediated endocytosis. I Sférické měchýřky složené ze syntetická lipidové dvojvrstvy, která se podoba biologickým membránám. r DNA je zabalena, přežívá a může být endocytózou dopravena do buněk. Ü Kationtové lipozomy - pozitivní náboj na lipozomech stabilizuje vazbu negativné] nabité DNA na povrchy lipozomů 1 Aniontové lipozomy internalizují DNA ■ Není omezena velikost transferované DNA I Nízká účinnost transferu i- Extrachromozomální inzerce (A) Water (C) Phosphate Lipid bilayer (B) I: In vivo liposome gene delivery. Anionic liposomes Cationic + liposomes +1 Transfer ĚZ Fusion Target cell Nucleus I m ■ Přímá injekce do tkáně (sval-DMD). M Gene gun: DNA je navázána na povrch kovové částice a „nastrelená" ■ Malá účinnost transferu do buňky Nízká hladina stabilní integrace I DNA se váže na cílovou molekulu, která se váže na specifický buněčný receptor, což může indukovat endocytózu a transfer DNA do buňky. i Vazba DNA (s negativním nábojem) se uskutečňuje přes polylysin (s pozitivním nábojem) kovalentně vázaný na receptor (např. asialoglykoproteinový receptor na jaterních buňkách). Plasmid DNA Poly lysine—transferrin conjugate Specific binding to transferrin receptor Lysosorne J Figure 22.7: Gene transfer via the receptor-mediated endocvtosis pathway. na inhibici genové exprese mutační korekce i ■ ■ ■ ■ ■ ■ Podstata terapie spočívá ve vyřazení exprese specifických genů, která umožňuje bujení nemocných buněk (inhibice onkogenu) Alelicky specifická inhibice genové exprese Místně specifická mutageneze in vivo Blokáda možná na úrovni: DNA (blokáda transkripce) RNA (blokáda post transkripčního processing, transportu mRNA nebo účasti mRNA na funkci ribosomů) Proteinu (blokáda posttranslačních úprav, exportu proteinů nebo dalších kroků k funkci proteinu) Transferovány do cytoplasmy pomocí lipozomu, potom mohou migrovat do jádra buněk pasivním transportem přes jadernou membránu. I Vážou se specificky jen na jednovláknovou NK (=antisense) -mRNA a inhibují tak expresi příslušného genu Jsou uměle konstruované- báze NK jsou přichyceny na pseudopeptidovou kostru. Normální fosfodiesterová kostra je| nahrazena polyamidovou (peptidovou) složenou z 2-aminoetyl glycinových jednotek. í PNAs jsou ve srovnání s DNA nebo RNA f* ■■■■VIVA V VVa jiaiVaVA flexibilnejší, coz umožňuje stabilnejší hybridizaci na DNA nebo RNA (pomocí vodíkových můstků). Jsou resistentní vůči endonukleázám. Některé molekuly RNA jsou schopny snižovat aktivační energii specifických biochemických reakcí a fungují tedy jako enzymy (ribozymy) Dvě komponenty: ! Cílové rozpoznávací sekvence M Katalytická komponenta š Ribonukleáza P ■ Intracelulární protilátky: MOligonukleotidové aptamery -oligonukleotidy schopné vázat se na specifické místo na proteinu ■ M u ta n tni proteiny Pro léčbu mutací typu "gain of function". 5'- niMMIIM II • I • t I • • • I I I • 3' )A % A G G YYYYYYYYYYYY! 51 s Catalytic ' component SM km fill Figure 22,9: Genetically engineered hammerhead ribozymes. 69��499549751994198� Table 22.5: Examples of gene therapy trials for inherited disorders Di Cells altered raov strate ficie T cells and hemopoietic stem cells iratorv epithel Familial hypercholesterolemia Liver cells ĎíioGAl using n /ID/I gene In wo GAT using recombinant to deliver the CFTfí gene LDL receptor gene (LD/.RJ if auamentati 0000 0000 Collected T lymphocytes from ADA" patient ADA mmň Retrovirus vector Expansion in culture ADA Recombinant Integration to give some ADA+ cells Infection Expression of introduced ADA «■ genes can overcome ADA deficiency Chromosomal DNA Selection of ADA+ cells Transfusion into ADA deficient patient 1: Ex vivo gene augmentation therapy for adenosine deaminase (ADA) deficiency. Table 22.7: Examples of cancer gene therapy trials Disorder Cells altered Gene therapy strategy Brain tumors Breast cancer Colorectal cancer Malignant melanoma Myelogenous leukemia Neuroblastoma Non-small cell lung cancer Ovarian cancer Renal cell carcinoma Small cell lung cancer Solid tumors Tumor cells in vivo Tumor cells ex vivo Hematopoietic stem cells ex vivo Fibroblasts ex vivo Hematopoietic stem cells ex vivo Tumor cells in vivo Tumor cells ex vivo Fibroblasts ex vivo Tumor cells in vivo Tumor cells ex vivo Fibroblasts ex vivo T cells/tumor cells ex vivo Tumor cells Tumor cells Tumor cells in vivo Tumor cells in vivo Tumor cells ex vivo Hematopoietic stem cells ex vivo Tumor cells ex vivo Fibroblasts ex vivo Tumor cells ex vivo Tumor cells in vivo Implanting of murine fibroblasts containing recombinant retroviruses to infect brain cells and ultimately deliver HSV-tk gene DNA transfection to deliver antisense IGF1 Retroviruses to deliver MDR1 gene Retroviruses to deliver IL4 gene Retroviruses to deliver MDR1 gene Liposomes to deliver genes encoding HLA-B7 and ß2-microglobulin Retroviruses to deliver IL2 or TNF gene Retroviruses to deliver IL2 or IL4 genes Liposomes to deliver genes encoding HLA-B7 and ß2-microglobulin Retroviruses to deliver IL2 gene Retroviruses to deliver IL4 gene Retroviruses to deliver TNFA gene Retroviruses to deliver HSV-tk gene Retroviruses to deliver antisense KRAS Retroviruses to deliver wild-type TP53 gene Retroviruses to deliver HSV-tk gene Retroviruses to deliver MDR1 gene Retroviruses to deliver IL2 or TNF genes Retroviruses to deliver IL4 gene DNA transfection to deliver IL2 gene Liposomes to deliver genes encoding HLA-B7 and ß2-microglobulin Table 22.6: Potential applications of gene therapy for the treatment of cancer General approaches Artificial killing of cancer cells Insert a gene encoding a toxin (e.g. diphtheria A chain) or a gene conferring sensitivity to a drug (e.g. herpes simplex thymidine kinase) into tumor cells Stimulate natural killing of cancer cells Enhance the immunogenicity of the tumor by, for example, inserting genes encoding foreign antigens or cytokines Increase antitumor activity of immune system cells by, for example, inserting genes that encode cytokines Induce normal tissues to produce antitumor substances (e.g. interleukin-2, interferon) Production of recombinant vaccines for the prevention and treatment of malignancy (e.g. BCG-expressing tumor antigens) Protect surrounding normal tissues from effects of chemotherapy/radiotherapy Protect tissues from the systemic toxicities of chemotherapy (e.g. multiple drug resistance type 1 gene) Tumors resulting from oncogene activation Selectively inhibit the expression of the oncogene Deliver gene-specific antisense oligonucleotide or ribozyme to bind/cleave oncogene mRNA Inhibit transcription by triple helix formation following delivery of a gene-specific oligonucleotide Use of intracellular antibodies or oligonucleotide aptamers to specifically bind to and inactivate the oncoprotein Tumors arising from inactivation of tumor suppressor Gene augmentation therapy Insert wild-type tumor suppressor gene MRI-guided stereotactic implantation of vector producer cells (VPC) into CNS tumors in situ Intravenous administration of gancyclovir (gev) (B) O A N. p. U U í )ŕ% Tumor regression Figure 22.13: /n wVo gene therapy for brain tumors. ÄÄrMfeÄÄ; VPC Tumor cell gov—*■ Gap junction i ■i Herpes simplex thymidine kinase gene M&m&fr Recombinant tk retrovirus tk gene product m TIME MAGAZINE May. 8, 2000 Bubble-Free French doctors score a gene-therapy triumph By CHRISTINE GORMAN The two infants, 11 months and eight months old, suffered from a rare life-threatening disorder called severe combined immunodeficiency. Because a genetic mutation kept their immune systems from fending off even the most innocuous infections, both faced lifelong confinement in sterile shielded environments. Now, 10 months after undergoing treatment in France to correct the defect, these " bubble babies" are out of their bubbles—back at home and acting for all the world like normal babies. LM O 2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1 LM02 je transkripčMfaktor nezbytný pro správni vývoj hemopoetických linif [n addition, Lmo2 transgenic mice wcic shewn to develop T-AL L (2 tí) within K) months, despite tlie fact that the transgenc expression was not restricted to T cells {29-32). 10000001 Among 11 kids who were cured 8 others normal thusfar, 3rd getting disease T lymphoblastic leukemia^ 10 15 20 25 30 35 40 43 Standard chemotherapy initiated Died Patient 4 6 13 T7 24 31 34 -C 37 É * A M I_________ B Patient 5 13 31 34 -C 37 3LTR 169 bpS 44,219 ďi; wo j 54.614 €6.467 66.867 71.646 ycU>^n~| ** I MFG yc H 4 P4 Integrace retrovirových vektorů do intronů LM02 genu Model: LM02 je transkripčně aktivní v časných progenitorovýl Retrovirus, který se integroval, zesiluje transkripci LMO"2 Šance na integraci do specifického genu je je 1 na 25,000. Další onkoproteiny jsou vytvářeny klonální expanzí Nakonec dojde k leukémii SUSI l« n li t» it ti tt ll i:ľ »ft «i ľ4 fô * * • » t «S é t • • 1"6 ľ7 ľ8 • * ♦ X Y Co by se mělo na současných protokolech změnit? Pro studie s retrovirovými vektory zaváděnými do kmenových buněk Snížit počet buněčných klonů, které se vracejí do těla pacienta Aktivně vyhledávat místa integrace a lépe integraci zacilovat Pro aplikaci postmitotických buněk (muskulární dystrofie) Bude pravděpodobně způsobovat problémy, neboť potřebujeme obrovské množství buněk, aby vůbec došlo k integraci Případ Jesseho Gelsingera Adenovirus, virus běžného nachlazení dsDNA Vysoký počet kopií (vytvoří se až 1012 částic/ml pro genovou terapii) Neintegruje se Infikuje a replikuje se v postmitotických tkáních (sval) Používá se podobně jako retroviry Příběh Jesseho Gelsingera Ornathine transcarbamylase (OTC) deficience Onemocnění ureového cyklu - fatální X-linked (Matka přenašečka, syn nemocný). 1/40,000. Někdy mozaicismus (Jesse) Kontrolováno nízkoproteinovou dietou a 32 prášky denně Stálé záchvaty křečí Terapie: adenovirus do portální žíly l Zemřel po 4 dnech na multiorganove selhání, jeho smrt se přičítá systémové reakci na adenovirový nosič Úspěchy genové terapie Ashanti de Silva úspěšně léčena pro ADA deficienci-1990 Ryes Evans úspěšně léčen pro SCID-2001 Genetic "