Detekcia mutácií v ľudskom genóme Vladimír Ferák Katedra molekulárnej biológie Prírodovedecká fakulta Univerzita Komenského Bratislava i Detekcia mutácií v ľudskom genóme A. IDENTIFIKÁCIA NEZNÁMYCH MUTÁCIÍ b. detekcia známych mutácií (diagnostické metódy) A. IDENTIFIKÁCIA NEZNÁMYCH MUTÁCIÍ I. Referenčná metóda: sekvenovanie I. Skríningové metódy založené na analýze: 1. homoduplexných NK: - DGGE (TGGE) - SSCP, REF 2. heteroduplexných NK: - HA (elektroforéza) -DHPLC 2 Detekcia mutácií v ľudskom genóme - pokr B. DIAGNOSTICKÉ METÓDY (cielená detekcia známych mutácií): - RA: reštrikčná analýza -ACRS: amplifikáciou utvorené reštrikčné miesto - ASO (SSO): alelovo špecifické oligonukleotidy - ARMS (ASA): alelovo špecifická amplifikácia - TaqMan (Real-time PCR) - PTT: „protein truncation tesť 3 DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Fischer a Lerman, 1979) Teoretické východisko; -väčšina DNA fragmentov sa skladá z 2 a viac denaturacných domén -stringencia denat. podmienok je funkciou sekvencie -pri elfo vo t koncentrácii denaturantu rýchlosť migrácie fragmentov pri určitej koncentrácii prudko i (denaturácia 1. domény). Princíp: separácia fragmentov na základe rozielnych podmienok denaturácie Metodické prevedenie: 1. Získavanie DNA fragmentov: PCR, RŠ 2. Elektroforéza - gél: PAGE - denaturant: urea a formám id (100 % denaturant -7 M urea a 40% formám id) - detekcia: farbenie striebrom, hybridizácia ■ typy gélov: - kolmé (perpendicular) - paralelné 4 DGGE Double stranded DNA DNÁ MOLECULES ANNEAL IN DISCRETE DOMAINS Complete strand separation High melting domain Low melting domain Increasing temperature/chemical denaturant i 5 DGGE GC-damp prirmerl Detection of single base polymorphisms DGGE/TGGE _______primer2 Mixture of PCR products Single size band on agarose gel Ol í-H- aT ~*1 A A A A A 1 >- -■ 1 'J "" i ^ V > ©w melting High melting 6 DGGE: charakteristika Charakteristika - dĺžka fragmentov 100-1000 bp - fragment musí obsahovať min. 2 denat. domény (neidentifikuje mutácie v doméne s najvyššou stringenciou denat.) - detekčná schopnosť je 50 - 70 % - "GC-clamp" - umelo priradená doména s vysokou stringenciou na 5'- koniec fragmentu: detekčná schopnosť cca 95% - nedáva informáciu o lokalizácii mutácie - TGGE - Temperature Gradient Gel Elpho - modifikácia DGGE (zvýšenie stringencie denaturácie pomocou zvyšovania teploty) SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism (Orita a spol., 1989) Teoretické východisko jednovláknová DNA za nedenaturačných podmienok vytvára terciárnu štruktúru, stabilizovanú vnutrovlaknovými interakciami mobilita ssDNA v nedenaturačnom PAGE je funkciou terciárnej štruktúry zámena báz (mutácia) môže viesť k zmene terciálnej štruktúry s následnou zmenou mobility Princíp separácia na základe rozdielnej terciálnej štruktúry ssDNA Metodické prevedenie Získavanie DNA fragmentov: PCR, RŠ Denaturácia fragmentov: teplota, formamid PAGE (nedenaturačný gél) 8 homozygot A SSCP heterozygot homozygot B SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism • Charakteristika: - Dĺžka analyzovaných fragmentov: do 400 bp - Detekčná schopnosť: <100% • Fragmenty 200 bp: cca 80% • Fragmenty 300 bp: cca 60% • Dlhšie fragmenty: štiepiť RE - Neinformuje o lokalizácii mutácie -Veľmi jednoduchá, široko využívaná metóda - Občas používaná aj pri diagnostike 10 SSCP v diagnostike A. Family 1002 B. Family 1006 SSCP v di agnostike Normal P121L M ulati on REF: Restriction Endonuclease Fingerprinting • Teoretické východisko: - ide o modifikáciu SSCP - analyzovaný fragment sa separátne štiepi 5-6 RE (získa sa 10-12 dsDNA obsahujúcich mutáciu - zmenená mobilita môže byť výsledkom: - zmenou sekundárnej štruktúry (SSCP komponent) - zmenou RM (RFLP komponent) • Metodické prevedenie: - PCR generujeme fragment - fragment separátne štiepime RE - zmiešame štiepne produkty - SSCP elfo (nedenat. PAGE gél) - detekčná schopnosť: veľmi vysoká; potrebujeme referenčnú vzorku (bez mutácie) 14 Metódy založené na analýze heteroduplexných NK heteroduplex - dvojvláknová NK, ktorá nevykazuje úplnú komplementaritu báz -------- N ^------ M denaturácia I reanealing y homoduplexy mismatch heteroduplexy .^ Heteroduplexová analýza • heteroduplexy majú zníženú pohyblivosť v nedenaturačných géloch • HA analýza mutácie G152fs v HGO géne G152fs 16 DHPLC: Denaturing High-Performance Liquid Chromatography Oefnara Underhill 1998 Princíp: detekcia prítomnosti heteroduplexov na základe ich kratšej retencie na chromatografickom nosiči za čiastočne denaturačných podmienok • nosič je pozitívne nabitý; DNA negatívne • retencia dsDNA je funkciou elektrostatickej interakcie (retencia je závislá na dĺžke fragmentu) • interakcia heteroduplexov je menej stabilná ako homoduplexov • parciálna denaturácia heteroduplexov spôsobuje významný posun v ich retencii na nosiči 17 DHPLC-po/cr. Charakteristika DHPLC • dĺžka fragmentov do 1,5 kb • senzibilita a špecifita > 95 % • detegovateľné mutácie: substitúcie, inzercie a delécie • rýchlosť: 3-5 min. na jeden fragment • získanie fragmentov: bežná PCR reakcia • odhalí prítomnosť mismatchu > samotnú mutáciu treba určiť sekvenovaním 18 DHPLC -pokr. parciálna denaturácia sa dá dosiahnuť teplotou (táto teplota sa dá stanoviť výpočtom na základe sekvencie fragmentu alebo empiricky) typickým obrazom DHPLC sú 4 piky (2 pre homoduplexy a 2 pre heteroduplexy) S'síd tj/p-a h/Hrsnl H -s -IwcKa l*jI a n a 3 cool -Jl Jl 11 O C 5 -i mV A ■." G 1 v v h§í3 TKKluptana^ AT G C II 67 "C & 6 Relerrion lime A l£__ V300G 200bp^- <- 200bp R58fs 23 ASO: Allele Specific Oligonucleotides SSO: Sequence Specific Oligonucleotides Princíp: pre každý oligonukleotid sa dajú určiť podmienky denaturácie, pri ktorých len úplná komplementarita zabezpečuje stabilitu dvojvláknovej štruktúry. Metodický postup: - PCR testovaného úseku - dot/slot blot hybridizácia na membráne • analýza jednej mutácie - zakotvenie testovaného fragmentu • analýza viac mutácií - zakotvenie panelu oligonukleotidov 24 ARMS: Amplification Refractory Mutation System ASA: Allele Specific Amplification • Princíp: mismatch PCR primeru na 3'konci znemožňuje PCR • Metodické prevedenie: - 3 primery: • 1 spec, pre normálnu alelu (N) - forward primer • 1 spec, pre mutovanú alelu (M)-forward primer • 1 spoločný (S) - reverse primer • plus pár primerov pre kontrolnú PCR reakciu - 2 PCR reakcie: NN NM MM • 1.PCRS-N + + • 2. PCR S-M + + 25 ARMS-PCR: princíp Forward N ---------------C ------------------------G --------------------------------------------------------------------- ----------------c-------------------------------^— Reverse S Forward M ---------------T ------------------------A --------------------------------------------------------------------- ------------------------T ----------------------------------------------^------ Reverse S ARMS primery M + S N + S | PCR produkty: MM + - PCR produkty: MN + + PCR produkty: NN - + Vyšetrenie 2. exónu génu GJB2 na mutáciu R127H pomocou ARMS-PCR Ladder M N M N M N Ladder CP produkt ARMS produkt- Genotyp: 500bp 400bp NN MN MM 27 ARMS: 12 3 4 5 MNMNMN MNMN NN NN NN MN NN 13 14 15 16 17 MNMNMNMNMN MN NN NN NN NN populačná štúdia 6 7 8 9 10 11 12 MNMNMN MNMN M N M N !•*■ -- MN MM NN MN MN MN MN 18 19 20 21 22 23 MNMNMNMNMNMN * MN NN NN MN NN NN TacjMan (Real-time PCR) TaqMan špecifická sonda: „reporter" a „quencher" DNA polymeráza pri PCR sondu odbúrava: reportér svieti TaqMan sonda hu l-lll H l*IM I9|l I •! lŕ denaturácia .........."■'-...........fcifc±Ji II LililJLll±eľJ annealing * polymerizácia TaqMan: priebeh 5 '-Primer ©___š> 5' © 3' 5' _© 3' 5' 3'-Primer © 3' 5' TaqMan 7700 Perspektíva: sekvenovanie - aj ako diagnostická, aj ako skríningová metóda DNA SEQ. LAB KtccaatccccaatggtcJ 0 90 116^1 534J *8QI . ■ .96Q I 1 -■------M 32 Celera's sequencing center in Rockville, MD. 33 PTT - Protein Truncation Test Metóda na identifikáciu mutácií skracujúcich príslušný Polypeptid (nonsense mutácie, splicingové mutácie, frame shift, ..) Metodický postup: • PCR generácia templátu - súčasne sa pridáva promotorova sekvencia T7 bakteriofága a eukaryotický iniciačný signál translácie • simultánna in vitro transkripcia a translácia - v systéme lyzátu králičích retikulocytov s použitím značených aminokyselín • elfo v SDS-PAGE • autorádiografia - mutácia sa prejaví ako prítomnosť skráteného polypeptidu • výhoda: detekcia viac mutácií v príslušnom géne (napr. mutácie zapríčiňujúce familiárnu adenomatóznu polypózu, FAP) 34