1
1
Molekulární patologie
Kateřina Kaňková
2
Program
I. část:
­ definice a vymezení
molekulární patologie
­ funkční klasifikace
mutací
­ rozdělení a
charakteristika efektů
mutací
II. část ­ příklady:
­ diagnostický a
terapeutický přínos
molekulární patologie
diabetes mellitus typu 1
­ prediktivní význam
molekulární patologie
pro stanovení prognózy
a plánování léčby
familiární
hypercholesterolemie
3
Definice patologie
studuje etiopatogenezi
nemocí
­ etiologie = příčina vzniku
nemoci (vyvolávající
činitel)
­ patogeneze = soubor
dějů provázejících vývoj
nemoci
soubor morfologických a
funkčních změn, které nelze
striktně oddělit (pat. anatomie
vs. fyziologie)
v klasickém pojetí rovněž
diagnostický obor zabývající
se diagnostikou nemocí a
příčin úmrtí na makro- a
mikroskopické úrovni
­ na úrovni organismu, orgánů,
tkání a buněk 4
Metody klasické patologie
pitva ­ inspekce
nekropsie (post
mortem)
biopsie (in vivo)
­ (imuno)histochemie
­ mikroskopie
světelná
elektronová
fluorescenční
5
Metody molekulární patologie
objasnění proč a jakým
mechanismem vede změna
sekvence DNA, RNA či proteinu
ke konkrétním patologickým
projevům
­ změna většinou získaná, v
somatických bb. nebo vrozené
u tzv. komplexních nemocí
diagnostika na molekulární
úrovni
­ nukleové kyseliny
­ proteiny
cytogenetika, FISH
PCR + RFLP, heteroduplexy,
SSCP, DGGE, sekvenování
microarrays
hybridizace
RNA/real time PCR
klonovani, transfekce,
mutageneze
izolace, separace proteinů,
blotting, ......
detekce apoptózy - DNA
fragmentation TUNEL, ......
metody molekulární patologie
6
Lékařská genetika
obor zabývající se většinou
monogenními, vrozenými
nemocemi
­ mendelistická dědičnost
­ tzv. geny velkého účinku (1 gen =
1 nemoc)
ale např. CF ~500 mutací!!!!!!
LDL receptor >700 mutací
náplň oboru:
­ patogeneze
­ diagnostika a predikce
­ poradenství
­ screening
2
7
Diag. využití mol. patologie
Onkologie
­ detekce zbytkové choroby po chemoterapii (MRD) a relapsu
­ zpřesnění klasifikace tumorů
chromosomální translokace (RT-PCR detekce bcr-abl mRNA,
t(9;22)
mutace onkogenů, supresorových a reparačních genů
­ mozaicismus po allogenní BMT
Hematologie
­ koagulopatie (poruchy kr. srážení)
hemofilie, von Willebrandova choróba, ...
­ familiarní trombofilie
Factor V Leiden, protrombin 20210A, C677T MTHFR,
­ andemie/přetížení železem
hereditární hemochromatóza
Mikrobiologie
­ detekce virů
EBV, CMV, HIV, HVB, C, ......
­ detekce bakteriálních patogenů
Helicobacter pylori, Mycoplasma tuberculosis, ...
Metabolismus, diabetologie a kardiologie
­ identifikace rizikových markerů nemocí
I/D ACE, HLA DB, DQ, MTHFR, apo(a), apoB, LDL receptor, ..........
­ identifikace genet. faktorů ovlivňujících efekty faktorů
prostředí
MTHFR, ......
­ identifikace genet. faktorů ovlivňujících efekt léčby
cytochrom P450 (CYP2D6, ........)
Forenzní patologie
­ DNA fingerprinting
­ DNA profiling
­ paternita
8
Klasifikace mutací - strukturní
podle mechanizmu
vzniku
­ délkové
delece (1bp ­ MB)
inzerce + duplikace
inverze
translokace
­ bodové mutace a SNP
silent (žádný efekt)
missense (záměna AK)
nonsense (stop kodon)
splice site (exon/intron
splicing site)
9
Vztah lokalizace mutací vs.
efekt
podle pozice v genu
­ 5' UTR (tj. promotor genu)
kvantitativní efekt (např. různá intenzita transkripce)
­ exony
kvalitativní efekt (např. různá sekundární a terciární
struktura, aktivita, afinita, ...)
­ introny
kvalitativní efekt (změna sestřihového místa)
kvantitativní efekt ? (vazba represorů nebo enhancerů)
­ 3' UTR
efekt na stabilitu mRNA
10
Klasifikace mutací - funkční
ztráta funkce (loss-of-function)
­ produkt genu je v důsledku mutace
nefunkční či je jeho funkce nedostatečná
získání nové funkce (gain-of-function)
­ produkt genu má v důsledku mutace
abnormální funkci
gene dosage effect
­ odstupňovaný efekt podle množství
produktu
11
"Loss-of-function" mutace
recesivní fenotyp
­ 50% množství produktu stačí
­ většina vrozených chorob metabolismu
nemocní/přenašeči
celá řada DNA změn může vést k loss-
of-function efektu
12
Mechanismy vzniku "loss-of-function"
efektu
delece celého genu
delece části genu
porušení struktury
­ translokace
­ inverze
inzerce do genu
porucha transkripce
promotorová mutace
snižující mRNA
pokles stability mRNA
inaktivace místa
sestřihu
vytvoření alternativního
místa sestřihu
frameshift translace
nonsense mutace
missense mutace
porucha posttranslační
modifikace
porucha celulární
lokalizace
porucha parenterálního
imprintingu a metylace
3
13
"Gain-of-function" mutace
změna DNA, která vede k vytvoření
nějaké nové kvality
dominantní fenotyp
­ typicky během maligní transformace
(mutace onkogenů vs. supresorů)
dominantně negativní
­ nejen ztráta funkce produktu jedné alely,
ale navíc blokáda funkce produktu normální
alely
14
Mechanismy vzniku "gain-of-function"
efektu
změna afinity k
substrátu, popř.
vazba jiného
substrátu
overexprese genu
receptor není
degradován, trvale
obsazen
iontový kanál
neustále otevřen
expanze
trinukleotidového
repeatu (CAG)n
strukturální
abnormalita
multimerických
proteinů
vznik chimerického
genu
neznámý
15
"Gene dosage" mutace
týká se většinou genů, jejichž produkty:
­ jsou součástí signálních nebo metabolických
kaskád
­ soutěží s jinými během embryonálního vývoje a v
metabolismu
­ fungují ve stochiometrickém poměru s jinými
na X-chromozom vázané nemoci
­ např. hemofilie
muži nemocní / ženy přenašečky (ale!!!)
inaktivace jednoho z páru X-chrom. vede k růzě
vyjádřenému onem. i žen
chromozmální numerické aberace
16
Numerické aberace
chromozomůpolyploidie
­ triploidie (69 XXX, XXY, XYY)
cca 2% všech početí, časný potrat
aneuploidie
­ gonozomální
XXX, XXY, XYY
normální očekávaná délka života, poruchy fertility
45, X
99% letální, jinak poruchy fertility a fyzické změny
­ autozomální
nulisomie (chybění páru chromozomů)
preimplantačně letální
monosomie (chybění 1 chromozomu)
embryonalně letální
trisomie (1 chromozom navíc)
až na výjimky většinou embryonálně či fetálně letální
 trisomie 13 (Patauův syndrom) - časné poporodní úmrtí
 trisomie 18 (Edwardův syndrom) - časné poporodní úmrtí
 trisomie 21 (Downův syndrom) ­ dožití cca 40 let
17
Využití mol. patologie k pochopení
etiopatogeneze nemocí
Příklady
­ (1) diabetes mellitus typu 1 (T1DM)
­ (2) maturity-onset diabetes of the young
(MODY)
­ (3) familiární hypercholesterolemie
18
T1DM ­ příklad 1
v důsledku autoimunitní destrukce -bb. LO u geneticky
disponovaných jedinců
­ 30 - 50% konkordance u MZT, 15% u DZT
cytotoxická autoimunita (Th1) zprostředkovaná T-
lymfocyty vede k postupné destrukci až úplnému chybění -
bb. a tím produkce inzulinu
spouštěcí faktory autoimunity ­ časová a geografická
variabilita!!!
­ virová infekce
zarděnky, spalničky, coxsackie B, CMV, EBV, enteroviry, retroviry)
­ zevní faktory
proteiny kravského mléka příliš brzy
nedostatek vitaminu D (severojižní gradient)
toxiny (dieta, voda, bakterie)
dynamika
­ manifestace obvykle v dětství, ve většině případů
autoimunita dokončena, absolutní závislost na
exogenním inzulinu
4
19
T1DM
20
Genetika T1DM
IDDM1 (HLA II lokus, 6p21)
­ asociace je výsledkem mnohočetných
vazebných studií
­ hlavní rizikové determinanty (alely)
u bělochů jsou DRB1 a DQB1 geny
DRB1*04_DQ8
DRB1*03_DQ2
cca 10% je non DRB1*04/DRB1*03
jiné HLA II haplotypy
­ DQ6 antigen (DQA1*0102 a DQB1*0602) má silný
protektivní efekt
nejsilnější riziko nese genotyp DRB1*04_DQ8/
DRB1*03_DQ2
heterozygotnost pro jednu z výše uvedených alel v
kombinaci s jinými představuje menší riziko
jakýkoliv genotyp obsahující DQ6 má dominantně
protektivní efekt
molekulární podstata asociace
­ rizikové a protektivní varianty HLA II mění 3-D strukturu
povrchového antigenu (krystalografie)
antigen-binding cleft
­ rozdíly v selektivitě prezentovaných peptidů (APC) a
stabilitě komplexů antigen/molekula HLA II
­ protektivní molekuly mají stabilnější vazbu antigenu
­ hypotézy
nedostatečná delece autoreaktivních T v thymu
rozdílná vazna na TCR a tím rozdílná imunomodulace T-lymf.
(proliferující × regulační)
21
Genetika T1DM
IDDM2 (INS lokus, 11p15)
­ asociace je výsledkem vazebných
studií
­ minisatelit (VNTR) v 5'UTR
repetice 14-15bp:
alela 1 (26 ­ 63 repetic) - riziková
alela 2 (64 ­ 139 repetic)
alela 3 (140 ­ 210 repetic) ­ protekční
(AD)
­ asociace není tak jednoznačná jako u
HLA II
náznaky paternální transmise
(maternální imprinting)
molekulární podstata asociace
­ insulin jako autoantigen
riziková varianta vede k nižší expresi
genu a tím navození menší
imunotolerance???
22
MODY (Maturity-onset diabetes of
the young) ­ příklad 2
cca 1% všech diabetiků v populaci
­ skupina monogenních diabetů s familiárním výskytem a dobře
definovaným mendelistickým způsobem dědičnosti (zpravidla AD), časnou
manifestací (dětství, adolescenci či časná dospělost) a bez vztahu k obezitě
­ cca 6 typů (MODY1-6)
­ patofyziologie: geneticky podmíněná dysfunkce -buněk ale dlouhodobě
měřitelný C-peptid bez známek autoimunity
­ dvě podskupiny
MODY v důsledku mutací v glukokináze (MODY2)
glukokináza = "glukózový senzor" (vázne uvolňování a produkce inzulinu)
lehčí forma bez výrazného rizika pozdních komplikací
MODY v důsledku mutací v transkripčních faktorech (ostatních 5 typů)
těžké defekty -buněk progresivně vedoucí k diabetu se závažnými pozdními následky
postižena glukózou stimulovaná tvorba a uvolnění inzulinu a proliferace a diferenciace -
buněk
MODY lokus gen produkt prim. defekt závažnost komplikace
1 20q HNF4A hepatocyte nuclear factor-4 pankreas vysoká časté
2 7p GCK glukokináza pancreas/játra mírná vzácně
3 12q TCF1 (HNF1A) hepatocyte nuclear factor-1 pancreas/ledviny vysoká časté
4 13q IPF1 insulin promoter factor-1 pancreas vysoká ?
5 17q TCF2 (HNF4B) hepatocyte nuclear factor-1 pancreas/ledviny vysoká renální
6 2q32 NEUROD1 NEUROD1 pankreas vysoká ?
23
Funkční význam asociací
HNF
­ většina
transkripčních
faktorů původně
popsaných ve
spojení s
jaterním
metabolizmem je
rovněž zapojena
ve vývoji
pankreatu a B-
bb.
IPF1 a NEUROD1
­ ovlivňují
transkripci
inzulinu
24
(Familiární) hypercholesterolemie
­ příklad 3
plynulá distribuce znaku -
hladin cholesterolu - v
populaci
­ kvantitativní znak (QTL)
osoby s FH
­ monogenní nemoc
5
25
Familiární hypercholesterolemie
způsobena mutacemi v genu
pro LDL receptor
popsáno více než 700 různých
mutací
heterozygoti se vyskytují
s frekvencí 1:500, homozygoti
1:1 mil.
z funkčního hlediska - ,,gene-
dosage" efekt:
­ úplná ztráta receptoru (17%
případů)
­ porucha transportu do pl.
membrány (54%)
­ porucha vazby LDL
­ porucha internalizace receptoru
po vazbě LDL
­ porucha uvolnění z endozomu
po internalizaci a návratu do
plazmatické membrány (22%)