Molekulární genetika člověka Somatické mutace a rakovina v Jana Smardova Patologicko-anatomický ústav, FN Brno - Bohunice Nádor, tumor, neoplazma, novotvar - je nová a abnormální tkáň v mnohobuněčném organismu, která v tomto organismu nemá fyziologickou funkci a roste neregulovaným způsobem. - je geneticky podmíněny abnormální přírůstek buněčné tkáňové hmoty klonálního charakteru. Jeho růst není v koordinaci s růstem okolních tkání a rovnovážným stavem organismu. Kancerogeneze je proces vzniku a vývoje nádoru podstatou kancerogeneze je postupné hromadění genetických (a epigenetických) změn Neoplastícka transformace -je přeměna somatické buňky v buňku nádorovou NuniiiLťu tiuňka Normálni hunk j S DbLcni Nk Vícestupňová kancerogeneze spojená s kroky klonalní expanze (selekce) í> Kolik a které geny jsou změněny během kancerogeneze? Nádor není monogenní onemocnění. Odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4-7 událostí (zásahů). Konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou desítky. Obecně existuje šest (sedm?) základních vlastností plně maligního nádoru: Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost Soběstačnost v produkci růstových signálů příklad aktivace H-ras ztráta RB Poškození apoptózy Neomezený replikační potenciál Posílení angiogeneze Tvorba metastáz produkce IGF aktivace telomerázy produkce VEGF inaktivace E-cadherinu Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech nutných změn? poškození apoptózy soběstačnost v produkci růstových signálů posílení angiogeneze ^v neomezený replikační potenciál necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus tvorba metastáz nestabilita genomu Kancerogeneze má individuální průběh Individuální je: pořadí zásahů počet zásahů konkrétní zasažené sen Onkogeny Protoonkogen je strukturní gen eukaryotické buňky, který se svým translačním produktem podílí do značné míry na regulaci dělení buněk a jejich diferenciace. Onkogen je Protoonkogen pozměněný/aktivovaný tak, že vyvolává neoplastickou transformaci buňky. Aktivace protoonkogenu je přeměna protoonkogenu na onkogen. Mutace protoonkogenu jsou: - aktivující - dominantní - vyskytují se v somatických buňkách a jen výjimečně v zárodečných buňkách Nádorové supresory Produkty genů pro nádorové supresory (antionkogeny) v normálních buňkách nevyvolávají proliferaci, ale naopak ji potlačují a udržují buňky ve stadiu klidu (G0). Jejich ztráta se projevuje neregulovanou proliferaci. Mutace nádorových supresorujsou: - inaktivující - recesivní („recesivní onkogeny") - spojeno s LOH - vyskytují se v somatických a také v zárodečných buňkách Onkoaenní (nádorové) RNA vir Retrovíry - obsahují ve svém genomu onkogen (akutně transformující viry) nebo aktivují Protoonkogen, vedle kterého se integrovaly (pomalu transformující) RNA viry a lidské nádory: • lidský lymfotropní virus typu I (HTLV-1) leukémie (lymfom) dospělých (ATTL) Onkoaenní (nádorové) DNA vír Používají jinou strategii transformace: neobsahují onkogeny, ale kódují proteiny, které interagují s nádorovými supresory (RB, p53, p300/CBP) hostitelské buňky, a tak hostitelskou buňku tlačí do S fáze: SV40: velký T antigen různými doménami interaguje s p53, RB, p300/CBP adenoviry: E1A interaguje s RB a p300/CBP; E1B interaguje s p53 papilomaviry HPV-16, HPV-18: E6 interaguje s p53, p300/CBP; E7 interaguje s RB Onkoaenní (nádorové) DNA vír DNA viry a lidské nádory: • Virus Epstein-Barrové (EBV) - Burkittův lymfom (BL). Hodkinův lymfom (HD), lymfomy, nazofaryngální karcinomy (NPC) • Virus hepatitidy B (HBV) - hepatocelulární karcinom (HCC) • Lidské papilomaviry (HPV 16, 18,..) - anogenitální nádory, nádory ústní dutiny, bradavice • Lidský herpesvirus typu 8 (HHV8) - Kaposiho sarkom (KS) Je rakovina nemocí buněčného cyklu? Regulace buněčného cyklu - bod restrikce - regulace fosforylace RB Mllogenlc P,ir]n,-irq Antl-Mltogenlc stgrifll* Struktura signální dráhy: klasifikace protoonkogenu Růstové faktory /T^^^P^^^/ • Receptory růstových faktorů a Ras-proteiny • Cytoplazm atické prenasece • Transkripční faktory Príklady signálních drah signální moieküiy> nrrjTGF.f} Ví TGF-I* rQceptor AD P KE) Růstové faktory a RTK receptory po vazbě svých specifických ligandů receptory dimenzují a dochází k autofosforylaci a také k fosforylaci dalších signálních molekul; tak může být zahájena řada vnitrobuněčných signálních kaskád autofosforylaci se změní konformace - zpřístupní se katalytická doména a vazebná doména pro substráty substráty interagují především prostřednictvím svých SH2 a SH3 (Src-homology) domén Typy mutací postihující růstové faktory a RTK receptory ítilii igoraiimmmm 132» Amplifikace receptoru: neadekvátně efektivní „vychytávání" extracelulárního signálu - buňky s koncentrovaným receptorem j sou pozitivně stimulovány k proliferaci, i když hladina extracelulárního signálu je nízká a za normálních okolností by mitogenní dráhu neaktivovala Změna struktury receptoru: jeho aktivace je nezávislá na vazbě ligandu Príklad růstového faktoru: PDGF PĎGF („platelet-derived growth factor") - účinný mitogen epiteliálních buněk - stimuluje endoteliální a epiteliální buňky k proliferaci v místě poranění - homodimer (AA, BB) nebo heterodimer (AB) dvou příbuzných řetězců A a B: B je kódován c-sis (y-sís přenášen virem opičího sarkomu: pozměněny B řetězec je konstitutivně exprimován a konstantně stimuluje k proliferaci buňky s příslušným receptorem) - exprese PDGF A nebo B nebo obou často detekována u sarkomů, gliomů, karcinomů plic, prsu, jícnu, žaludku, střeva Príklad membránového receptoru - HER2/neu HER2/neu kódován genem c-erb&2 - receptor homologní s EGFR, ale neváže ani EGF ani TGF-a a zřejmě ani neu - amplifikace c-erbB2 detekována u adenokarcinomů slinných žláz, prsu, vaječníku, střeva a žaludku; u karcinomu prsu a vaječníku amplifikace a zvýšená exprese c-erbB2 koreluje s horší prognózou a rezistencí k terapii * - amplifikace c-erbB2 detekována častej i ve vzdálených metastatických místech než u primárních nádorů Príklad membránového receptoru - HER2/neu * Amplifikace HER2/neu je uznávaným prognostickým a prediktivním faktorem u nádoru prsu; pacientky s amplifikací HER2/neu podstupují radikálnější terapii a mohou být léčeny Herceptinem - monoklonální protilátkou rozpoznávající protein HER2/neu - asi u 33% primárních nádorů prsu a vaječníku detekována mutace v transmembránové doméně V664E dávající vznik variantě pl85erbB2, která je konstitutivně dimenzovaná -konstitutivně aktivní a konstitutivně stimulující MAPK Proteiny Ras Po aktivaci RTK receptoru zprostředkovávají vazbu Raf-1 k cytoplazmatické membráně, kde jsou přítomny další faktory účastnící se aktivace Raf-1, a spoluaktivují Raf-1 Fosforylováné zbytky RTK jsou vazebným místem pro proteiny s SH2-doménami (GRB2). Tyto proteiny jsou fosfory lo vány a signál potom přenášejí dále prostřednictvím Ras proteinů. ® j, j, ) r (bi NUCLEUS Proteiny Ras Proteiny H-Ras, N-Ras a K-Ras4A a K-Ras4B (189 AA) mají 188 aminokyselin (p21Ras). Jsou lokalizovány na vnitřní straně cytoplazmatické membrány, kde fungují jako přepínače při přenosu extracelulárních signálů do cytolazmy. Účastní se řízení buněčného cyklu, diferenciace a apoptózy. Ras-proteiny mají GTPázovou aktivitu: jsou inaktivní, váže-li se na ně GDP, a aktivní, váže-li se na ně GTP. Vlastní schopnost Ras-proteinů vyměňovat GTP/GDP a hydrolyzovat GTP je nízká, proto nutná účast dvou typů proteinů: 6TPázový cyklus proteinu Ras Growth Factors and Other Signals Guanine nucleotide exchange factor 3 GEF Ras GTP—^ Effectors G T Pase activating protein GAP GEF S posilují tvorbu aktivního Ras, který váže GTP GAPs aktivují GTPázu, posilují tvorbu inaktivního stavu Ras, který váže GDP Onkogenní aktivace ras Přítomnost onkogenní mutace ras detekována téměř u 35% nádorů. • Mutace H-ras hlavně u nádorů kůže a dlaždicobuněčných nádorů hlavy a krku. • Mutace K-ras hlavně u adenokarcinomů, karcinomů chrupavek, kolorektálních nádorů a nádorů pankreatu. • Mutace N-ras j sou běžné u hematopoietických malignit, hlavně u AML a MDS. Onkogenní aktivace ras Onkogenní mutace posilují aktivitu Ras: • V kodónech: 12,13, 59, 61, 63 - vzniklé proteiny mají poškozenou GTPázovou aktivitu a jsou rezistentní k působení GAP proteinů • V kodónech 16,19,116,117,119,144,146 - vzniklé proteiny mají usnadněnou výměnu GDP/GTP U některých nádorů je zvýšená exprese ras Protoonkoprotein M Do rodiny proteinů Myc patří tři odlišné proteiny, které se uplatňují v kancerogenezi: c-Myc, N-Myc a L-Myc. Myc je jaderný fosfoprotein s mnoha znaky transkripčního faktoru. Myc tvoří heterodimery s proteinem Max. • Dimer My c/Max transaktivuje několik genů, které se podílejí na řízení buněčné proliferace. • Myc upreguluje aktivitu telomerázy transaktivací katalytické podjednotky hTERT. • Rada genů regulovaných Myc není transaktivována, ale naopak jejich transkripce je reprimována. c-Myc, N-Myc, L-Myc Jsou si podobné svou strukturou a mechanismem účinku. Výrazně se liší expresí během vývoje a také se zdá, že ovlivňují - i ve stejném buněčném kontextu - jiné sady genů, participují - i ve stejných buněčných typech - na jiných buněčných programech. Liší se významně také svou úlohou ve vývoji jednotlivých typů neoplastických onemocnění. c-myc a nádory-1 BurkitSv lymf om: Téměř všechny případy Burkitova lymfomu souvisí s translokací genu c-myc (na chromozómu 8) buď s těžkým řetězcem \i nebo X nebo lehkým řetězcem k imunoglobulinů (na chromozomech 14, 22 a 2). Někdy bývá translokace doprovázena i výskytem somatických mutací v genu c-myc, a to především v oblasti fosfory lační ch míst Thr58 a Ser62. Tyto mutace přispívají významně k fenotypu a progresi onemocnění. c-myc a nádory - 2 Ostatní lymfomy: JTiET5«P • • aiiwj translokací Ig/Bcl-2, jen vzácně lze detekovat přestavby c-myc. 60-80% těchto lymfomů transformuje v agresivnější formu a u těch už jsou detekovány i přestavby lg/c-myc. íražl "iraitu IriBlil Mi heterogenní a asi u 50% lze detekovat translokaci Ig buď s BCL2, BCL6 nebo c-myc. c-myc a nádory - 3 Solidní nádorv: u významného podílu invazivních duktálních karcinomů prsu (spojeno s horší prognózou), u některých nádorů prostaty, u gastrointestinálních nádorů (souvislost c-/7ryc:APC:ß-katenin: jaderný ß-katenin slouží jako koaktivátor TF Tcf-4, který transaktivuje c-myc), u některých melanomů a u mnohočetného myelomu (koreluje s agresivitou onemocnění). N -myc a nádory Amplifikace N-myc se vyskytuje asi u 1/3 případů neuroblastomu a je spojena s horší prognózou onemocnění. Zvýšená exprese N-myc byla popsána u významného podílu případů malobuněčného nádoru plic a u menšího počtu případů medulárního tyroidního nádoru, retinoblastoma rhabdomy o sarkomu a nádoru prsu. L-myc a nádory r V r im*syATA!icí^ myc) byla pozorována u některých případů malobuněčného karcinomu plic. Nádorové supresory Individuální dispozice k nádorům 1. Rozdíly v metabolismu kancerogenů např. cytochrom P-450, CYP2D6, CYP1A1, N-acety ltransferáza,... 2.-3. Rozdíly v DNA repair Mutace nádorových supresorů (a onkogenů) - p53, RB, WT1, BRCA1 aBRCA2,... -RET Penetrance: podíl jedinců určitého genotypu, u nichž se daný specifický genotyp fenotypicky projeví (pravděpodobnost výskytu daného nádoru v určitém věku). Retinoblastom Je vzácné, ale velmi dobře známé nádorové onemocnění dětí. Incidence - 1 na 13.500 - 25.000 narozených dětí. Je prototypickým příkladem vrozené dispozice k nádorům: Na základě studia epidemiologie retinoblastomu byla vytvořena Knudsonova hypotéza —» Knudsonův model. RB byl prvním příkladem nádorového supresoru a první klonovaný gen pro nádorový supresor. Vrozená mutace RB (13ql4) predisponuje nositele k vývoji retinoblastomu (maligní tumor, který vzniká ve vyvíjející se retině) v nízkém věku a přináší zvýšené riziko vývoje osteosarkomu. Knudsonuv model dvou zásahu průměrný věk při diagnóze - 14 měsíců bilaterálně v obou očích - v průměru 3 nezávislé nádory v případě časného odstranění retinoblastomu vysoký výskyt osteosarkomů mezi 20. a 30. rokem života často rodinná anamnéza bez rodinné anamnézy průměrný věk při diagnóze - 30 měsíců unilaterální výskyt Knudsonuv model dvou zásahu Knudson (1971): 1. skupina: 1 mutovaná alela genu RB je zděděná (v zárodečné linii), druhá mutace somatická 2. skupina: nezbytnost dvou nezávislých mutací obou alel RB jedna hypotéza vysvětlila dva epidemiologicky odlišné typy onemocnění Knudsonöv model dvou zásahu NORMÁLNÍ, ZDRAVÝ JEDINEC NEDEDICNY RETINOBLASTOM DEDICNY RETINOBLASTOM děděná alela genu RB1 V jedné buňce náhodně mutuje jedna ze dvou standardních alel genu RB1. oooo V jedné buňce mutuje druhá alefa genu RB1. Netvoří se nádor. Druhá aleta mutuje jen velmi zřídka v téže buňce. -*■ Nadměrná profiferace*- buněk vedoucí k retinoblastomu. Pouze asi v 1 ze 30 000 jedinců se vytvoří nádor. U většiny jedinců se vytvoří nádor. Ztráta heterozygotnosti Ztráta heterozygotnosti = LOH („lost of heterozygosity") • Buňky, které nesou jednu mutovanou alelu nádorového supresoru, ztrácejí velkou část (delece) chromozomu, který nese funkční alelu. Předpokládá se, že v oblastech s vysokou frekvencí LOH leží geny nádorových supresoru. Buňky, které nesou jednu mutovanou alelu nádorového supresoru, ztrácejí jedním z více možných způsobů funkční alelu. Ztráta heterozygotnosti mutace X vatele genu RB1 mateřského chromozomu ■ 1 1 standardní alela genu RB1 v otcovském chromozomu ztráta heterozygotnosti I m SS nondisjunkce nondisjunkce mitotická {ztráta a duplikace rekombinace chromozomu) ! hi ! genová delece bodová konverze mutace RB: gen a protein gen je lokalizován na chromozómu 13 jaderný (85%) protein ppi ÍO116 (velikost 112 až 114 v proliferujících buňkách) V nedělících se buňkách je RB v komplexu s TF E2F. E2F transaktivuje sadu genů, které jsou nutné k S fázi buněčného cyklu. RB blokuje E2F a tím blokuje buněčný cyklus („brzda buněčného cyklu"). Hladina proteinu RB se v buňkách nemění během b.c., ale mění se stupeň fosforylace RB. Na molekule RB je asi 10 až 12 různých fosfory lační ch míst (Thr, Ser). Hypo sforylo váný RB je aktivní a váže E2F, fosfory lovaný RB je neaktivní. RB a regulace buněčného cyklu (c ik4/6) - ^ i- allogenic Sl-anels (cdk4/6) 21 WAF1 l p27KÍP1 p15 JNK4B p16INK4A 1 t Anti-Mltog&nlc strait Způsoby inaktivQce RB v nádorech Samotný gen RB může být mutován, deletován, může být metylován jeho promotor (retinoblastom, malobuněčný karcinom plic, sarkomy, karcinomy močového měchýře). Vazbou virových proteinů El A, LT SV40, E7 (karcinom děložního čípku). Amplifíkací cy klinu D1 (nádory jícnu, prsu, dlaždicobuněčné karcinomy) nebo zvýšenou expresí cy klinu D1 díky chromozomální translokaci (lymfomy B buněk). Potenciálně onkogenní virus Herpesvirus saimiri kóduje svůj vlastní cyklin D. Způsoby ínaktívace RB v nádorech • Amplifíkací Cdk4 (glioblastomy, gliomy). • Delecí p 15, pl6 nebo obou (dlaždicobuněčné karcinomy jícnu, glioblastomy, karcinomy plic, močového měchýře a pankreatu). Ektopická exprese „wild-type" RB není inhibující pro proliferaci, protože RB je fosforylován a inaktivován endogenní aktivitou komplexů cyklin/cdk. Li-Fraumeniho syndrom Vzácné autozomálně dominantní dědičné onemocnění. Rodinný syndrom charakteristický častým a časným výskytem malignit různého typu včetně sarkomu, nádoru imMKtHHiBnniii nádoru. Nádory u LFS mají tendenci se objevovat u dětí a mladých dospělých, často jako násobné primární nádory. Syndrom spojen s mutací genu pro nádorový supresor (17pl3). Rodokmen rodiny s LFS CO - colon cancer BB - bilateral breast cancer BR - breast cancer SS - soft tissue sarcoma OS - osteosarcom CN - brain tumor LK - leukemia Gen a protein p53 Gen leží na chromozómu 17 (17pl3) a má 11 exonů (z nichž první se neexprimuje). Protein je jaderný fosfoprotein, 393 AA, 53 kDa; v r C* ntgUKieiiUiijiii m dm 2 - zpětnovazební inhibiční klička p21«Pl/WAFl_blokG1 bax- apoptóza 6ADĎ45 - oprava DNA Signalizace p53 DNA Damage Gl ARREST APOPTOSIS G2 ARREST p53-dependents blok v Gl - pai^/WAFi DNA damage Apoptoslš DMA repair ____________. I protein I p2l gen« — -------------' 1 Cyclfn/COK complexes PRB-E2F pRB-P + E2F PCNA 1 I DNA replication Gl [ G2 p53 - ochrance genomu Increase of p53 protein level, trans activation of cell-cycle control genes, ^* cell-cycle arrest in G1 ^**^\)\ DNA repair before cell division (low levels of damage) Apoptosis (Irreparable damage) No wild-type p53, no cell-cycle arrest In G1 Division of damaged cells (mutations, aneuploldy) CS MALIGNANT CLONE Mitosis not completed, cell death Inaktivace p53 v nádorech Mutace Jaderná exkluze (37% zánětlivých karcinomů prsu, více než 90% nediferencovaných neuroblastomů) LllIaJKlí UJMlIHHM Amplifíkace mdm2 (neuroblastomy), případně mdmX (gliomy) Frekvence mutací p53 v nádorech Estimated Cancers with Mutant p53Gene 137 255 455 64 191 B 39 26 15 14 62 50 9 28 31 41 23____________ 1013 Total Developed Countries 400 300 200 No. of Cases ' (x-IOOO) >/\ 100 0 100 Developing Countries 200 300 400 l—l—h + 333 STOMACH -\------í 338 90 ÉPAHcftÉA&h 47 S3 ^TffTHTj 67 Estimated Cancers with Mutant p53 Gene 138 115 54 90 370 30 101 114 75 15 21 24 5 12 30 21 ___________29. Total 674 Typy mutací p53 především bodové missense mutace krátké delece a inzerce (více v okrajových částech genu) distribuce není pravidelná - především centrální DNA vazebná doména - oligomerizační doména - introny (v místech sestřihu) - „hot spots" Distribuce „missense" mutací v molekule p53 Nejčastěji mutované kodóny p53: 175, 245, 248, 249, 273, 282 Mutace p53 v nádorech typické spektrum mutací u určitých nádorů typická spektra pro určité kancerogeny („fingerprints") některé mutace typické pro určitý genetický background (BRCA1,BRCA2) různé mutace mohou mít různý dopad na vlastnosti nádoru (částečná inaktivace, konformační mutace, korelace genotypu a fenotypu) zřejmě se liší mutační spektra somatických a vrozených mutací Genetická nestabilita nádoru Nádory vznikají postupnou akumulací genetických (a epigenetických) změn genů, které řídí buněčné dělení, buněčnou smrt a další důležité procesy v buňce. Z výpočtu, který vycházel ze známé mutační rychlosti v somatických buňkách (10~7 na gen na generaci buněk), se zdálo, že k takové akumulaci mutací nemůže během lidského života dojít. Jakým mechanismem dochází k této akumulaci? Genetická nestabilita nádoru K akumulaci stačí normální rychlost mutací ve spojení s vlnami klonální expanze, které mohou být způsobeny pozitivní selekcí buněk "prenádorových". Akumulace všech nutných mutací umožněna genetickou nestabilitou (tzv. „mutator hypothesis"). Nestabilita je záležitost rychlosti, s jakou k mutacím dochází, existence mutací sama o sobě neposkytuje žádnou informaci o tom, s jakou rychlostí se objevila. Většina nádoru je geneticky nestabilních. Typy genetických změn v nádorech 1. Menší změny v sekvenci DNA - missense mutace, menší delece a inzerce (např. missense mutace K-ras se vyskytuje u 80% nádorů pankreatu, převážně missense mutace p53 u téměř poloviny všech nádorů,..) 2. Změny v počtu chromozómů - ztráty případně zisky celých chromozómů (ztráta chromozómu 10 u glioblastomů spojena se ztrátou nádorového supresoru PTEN; získání chromozómu 7 u papillary renal karcinomů spojeno s duplikací mutantního onkogenu MET) 3. Chromozomální translokace - fuze částí odlišných chromozómů nebo normálně nesouvisejících částí téhož chromozómu (na molekulární úrovni může být doprovázeno fúzemi mezi dvěma odlišnými geny) (Philadelphský chromozóm a další translokace typické pro řadu leukémií) 4. Amplifikace genů (amplifikace genu N-myc u 30% neuroblastomů) Ke genetické nestabilitě dochází na více úrovních. Nestabilita v sekvenci DNA Tento typ nestability je u lidských nádorů vzácnější, ale když se vyskytne, má dramatické následky. Zdrojem nepřesností při replikaci DNA jsou chyby vzniklé při DNA polymeraci (tj. kvalita DNA polymeráz a souvisejících „proofreadingových" procesů) a chyby v DNA repair systémech. U nádorů nebyly prokázány defekty v DNA polymerázách, ale byly prokázány defekty ve dvou hlavních systémech DNA repair. 1. Nukleotidová excizní oprava („nucleotide-excision repair" - NER) - s ní spojená nestabilita („NER-associated instability" - NIN) 2. Oprava špatného párování („mismatch repair" - MMR) - s ní spojená mikrosatelitová nestabilita (MIN) Oprava špatného párovaní - MMR enzymatické odstranění chybně zařazených nukleotidů při replikaci MMR studován v souvislosti s nádory po objevení skupiny sporadických kolorektálních nádorů, u kterých byly v genomu nalezeny rozsáhlé změny v oblastech poly (A). Později byly nalezeny obdobné změny také v poly(CA) opakováních a tento jev dostal označení mikrosatelitová nestabilita - MIN. MIN se vyskytuje u většiny dědičných non-polyposních kolorektálních nádorů (HNPCC). Oprava špatného párovaní - MMR • Mutace MMR jsou recesivní, tzn. jedna "funkční" alela je dostatečná k udržení normální hladiny MMR, teprve po inaktivaci druhé alely příslušného MMR genu se začnou kumulovat mutace. Nositelé jedné mutantní alely v zárodečných buňkách jsou disponováni k vývoji nádorů. Mutace v genech MMR se nejčastěji vyskytují u kolorektálních nádorů, u nádorů endometria, a u nádorů žaludku (asi 13-15%), u jiných typů nádorů jsou vzácné (asi 2%) Dědičný nepolypózní kolorektal™ karcinom - HNPCC = Lynchuv syndrom HNPCC představují asi 2-4% kolorektálních nádorů v západních zemích. Průměrný věk detekce nádoru u HNPCC pacientů je 40 let. Pacienti nemají zvýšený počet prekurzorových adenomů. Celoživotní riziko vývoje CRC je pro ženy 50%, pro muže 80% a celoživotní riziko vývoje nádoru dělohy i e 60%. Pacienti s HNPCC ohroženi dále nádory vaječníku. ĚfiLlíii n/glileifrfgli «■illlj^i Vývoj nádorů souvisí s mutacemi genů MMR, nádory jsou geneticky nestabilní a progredují rýchlejšou ale méně agresivní než FAP Qsou diploidní). Dědičný nepolypózní kolorektal™ karcinom Syndrom je spojen s vrozenými mutacemi genů pro „mismatch repair", je pro ně typický mutátorový fenotyp RER+: MSH2(první detekovaný; 2pl5-16, 106 kDa) df£///(3p21;85kDa) - tyto dva odpovídají za více než 90% všech vrozených mutací P/IAS1 (2q3l) P/MS2(7p22; 96 kDa) MSH6 - odpovídá za odlišný fenotyp Nestabilita v počtu chromozomu CIN Ve srovnání s NIN a MIN j sou ztráty nebo zmnožení celých chromozomů mnohem běžně j ší a vyskytují se téměř u většiny nádorů - např. 85% kolorektálních nádorů je vysoce aneuploidních. Běžná j e ztráta chromozomu související s LOH, často je doprovázena získáním opačného chromozomu. => Ne vždy změny karyotypu souvisejí s CIN! Oba typy nestability se objevují spíše v ranných fázích vývoje nádoru a během dalšího vývoje nádoru se hromadí genetické změny jako následek této nestability. Molekulární podstata CIN Během buněčného cyklu se vyskytuje několik kontrolních bodu, které monitorují správný postup buněčného dělení a zajišťují, aby před vstupem buněčného cyklu do další fáze byly předchozí fáze zcela a bezchybně skončeny. Pozastavení vstupu do mitózy při poškození DNA (A) Pozastavení kondenzace chromozómů při poškození mikrotubulů (B). Pozastavení separace chromatid při nesprávném připevnění chromozómů (C). Pozastavení vytvoření dceřinných buněk při nesprávné orientaci vřeténka D). Phase G2 STOP Prophase STOP Prometaphase Cytoplasm Metaphase STOP Anaphase STOP I Microtubule-organizing centre (centrosome) •>^_ Duplicated chromosome (condensed) . Microtubules ^^Vv^ Uncondensed chromosomes *«U Telophase I Kontrola poškození DNA Chromozomy obsahující poškozenou DNA mohou nesprávně segregovat, protože sesterské chromatidy mohou být spojeny (DNA-DNA, DNA-proteiny); chromozómy obsahující jednořetězcové "gaps" nebo zlomy v obou řetězcích jsou náchylnější k rozsáhlým přestavbám =^> nestabilita související s defekty v kontrole poškození DNA jsou často spojeny s posílenou mitotickou rekombinací a s aberantní segregací chromozómů. Kandidátní geny: ATM („ataxia telangiectasia mutated"), ATR („ATM-related gene"), BRCAl, BRCA2, p53. Kontrola mitotického vřeténka Tento kontrolní bod („spindle check-point") zajišťuje, aby se sestreské chromatidy nerozcházely dříve, než jsou všechny chromozómy správně uspořádány kolem mitotického vřeténka. Prophase —=-^—Centrosome .Kirietochore Microtubules Anaphase a. Profáze: začíná se tvořit vřeténko ve formě mikrotubul organizovaných centrozómy na pólech buňky; b. Metafáze: vřeténko je vytvořeno a chromozómy se začínají připevňovat k vřeténku v oblastech nazývaných kinetochory; c. Anafáze: chromozómy se pohybují se zkracujícími se mikrotubuly směrem k pólům buňky, kinetochory napřed. Kontrola mitotického vřeténka i Bub r,2, 3' Mad 1. 2\ 3 Mps 1 OFF _|Cdc2Ü—»-APO Active Active Bub1*,2,3*HCdc20 Mad 1, 2*H 3 Mp3 1 Anaphase ON inactive Inactive Metaphase arrest Jak je monitorováno sestavování vřeténka? Na nesprávné sestavení vřeténka reagují proteiny typu Bub a Mad a nedovolí aktivaci APC Familiální adenomatózní polypoza - FAP Autosomálně dominantní dědičné onemocnění. U pacientů s FAP se vyvíjejí stovky až tisíce benigních kolorektálních nádorů, z nichž některé progredují do karcinomů, nej častěj i během druhé a třetí dekády života. Průměrný věk detekce nádoru u FAP pacientů je 40 let. Polypy, které se objevují u pacientů s FAP jsou totožné s polypy sporadickými a také nemají větší riziko maligní progrese než sporadické polypy. Ale jejich velký počet „zajišťuje", že některé se s jistotou v maligní vyvinou. Pacienti s FAP mají zvýšené riziko thyroidních nádorů, nádorů tenkého střeva, žaludku a mozku. Familiální adenomatózní polypoza FAP je spojena s vrozenými mutacemi genu APC. Ten je lokalizován v oblasti 5q21. Během kancerogeneze musí být inaktivovány obě kopie genu APC (<=> častý LOH 5q). Somatické mutace APC také hrají klíčovou úlohu při vývoji sporadických kolorektálních karcinomů, j sou detekovány alespoň u 80% všech CRC. Vysoký podíl mutací, které vedou ke zkráceným proteinům. Relativní vztah mezi typem mutace a průběhem onemocnění. Dvoii úloha proteinu APC v buňce: A. Regulace hladiny volného ß-kateninu E-Cadherin Nuclear Membrane . Target ^^ Genes Dvojí úloha proteinu APC v buňce: B. účast na tvorbě mitotického vřeténka a Wild-1 Csntroson ^m 1 ype oeJls na APC El 3-1 ______ KinätochCHfi ľ fJ^J^M^ZLr***^^ ***^^T^ľ ^~^^-_ u*p- ^^Sbŕ^ 'Kr____ Tílr1 Microtubutes - APC je lokalizováno na kinetochorech metafazických chromozomů. Důsledkem mutace APC je poškození mitotického vřeténka a tím zvýšení chromozomální genetické nestability. Dvojí úloha APC při vývoji CRC APC se zřejmě uplatňuje jak při iniciaci vývoje nádoru (v důsledku selektivní výhody získané aktivací Wnt/ß-katenin dráhy), tak také v pozdějších fázích vývoje nádoru tím, že je příčinou chromozomální nestability. Mutace APC predstavuj e nejčastější první krok v kancerogenezi kolorektálního karcinomu kolorektalniho karcinomu relativně „standardní" průběh od malých adenomů (do 1 cm), přes středně pokročilé (více než 1 cm bez známek transformace) a velké adenomy až po plně rozvinutý maligní CRC wlmm IniestirMlßTHihßiial nrypts Abomnt nryptfoajs Arlmorna Vývoj kolorektálního karcinomu Kolorektální karcinomy představují výborný model pro studium kance r oge něze: relativně „standardní" průběh od malých adenomů (do 1 cm), přes středně pokročilé (více než 1 cm bez známek transformace) a velké adenomy až po plně rozvinutý maligní CRC souvislost mezi morfologií jednotlivých stadií a genetickými změnami, které se odehrály model kooperace onkogenu a nádorových supresoru během kancerogeneze Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - aktivace ras Specifické bodové mutace protoonkogenu K-ras nebo N ras jsou detekovány alespoň u 50% kolorektálních adenomů větších než 1 cm a asi u 50% karcinomů. Mutace ras jsou jen vzácně (do 10%) detekovány u adenomů menších než lem. mutace ras se typicky objevují při progresi adenomů Frekvence mutací ras u kolorektálních karcinomu 70 60 - +* 50 - (0 c/> 40 - ^ 30 - 20 - 10 - Early Intermediate Late ■ Adenomas Cancer Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - „LOH" 18c Delece oblasti 18q detekovány u 50% velkých adenomů a 70% karcinomů. Na chromosomu 18q detekován gen pro SMAÖ4, někdy označovaný jako DPC4 („deleted in pancreatic cancer"). SMAD4 je součástí signální dráhy TGF-ß. Frekvence delecí oblasti 18q u kolorektálních karcinomů 90 80 70 eo 50 40 tO 30 20 10 £fi &££??-:#.¥ Early Intermediate Late Adenomas Cancer Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - inaktivace p53 Ztráta 17p je detekována u 75% kolorektálních karcnomů. Ztráta 17p je jen vzácně detekována u kolorektálních adenomů. inaktivace nádorového supresoru p53 je typicky pozdní událost během vývoje kolorektálních karcinomů Frekvence mutací p53 u kolorektálních karcinomů Vývoj kolorektálního karcinomu: model mnohostupňové kancerogeneze lni3£t™iRfdľiGiial nrypts Aberrant crypt focus ArtprííTíi Carcinoma I APC iW*! ť rV.aWfflBgaäfc kjtas SMAO&SMADé 7P53 Other oncogenes? Ľhíomosonne Chromosome ISqLOH 17pLGH Vývoj kolorektálního karcinomu: model mnoho stupňové kancerogeneze normálni epitel AC F malý adenom strední adenom r~ velký adenom APC K-ras 18q LOH p53 SMAD4 DCC