FarrnsikogBriB'iika PřF 1.12.2006 Cíl M Na základě interdisciplinárního integrace znalostí farmakologie a genetiky popsat vliv dědičnosti na odpověď organismu na různé léky. ■ Farmakogenomika !)] Farmakodynamika: popisuje žádoucí či nežádoucí účinky léku na organismus (lék-> organismus) M Farmakokinetika: se zabývá hladinami léků a jeho metabolitů v různých tkáních a vstřebáváním léků, jejich distribucí, metabolismem a eliminací (organismus -> lék) Klíčové složky farmakogenetiky Pharrnacog&nalics Drug targets Drug trangpurteis Drug metabolizing enzymes I J Pharmacodynamics Pharmacokinetics TflENIW.Yl Ü&wr.i3 Klinický potenciál farmakogenetiky PatiefilÉ wilh sama u=auiiü«i& t * * t +á * t t *'f Rratseled good r-teponsö lo lasladdnug t I \ '.« í** i í v» Píůtfietod úůůí Predoôd inouasod or non räsponse Jsa dilfoľunl drug toxicity risk Dacŕcasa close or use dlflc-rcnt drug řrlc.MUSňl Ĺje/Wffics Patients under cirMg inealmenl unojcpeued outcomec i ierk5ua-sidE&ir^r:h. i fciadequate nesporas Farmakogenetika a vývoj léků ■ Nutnost přesné diagnózy (k fenotypicky podobným stavům mohou vést různé patobiochemické mechanismy). ■ Individuální odpověď jedince na terapii může záležet na genech, vstupujících do interakce s metabolismem léku nebo jeho působením. ■ Polovina všech dosud používaných léků je metabolizována enzymy P450. P450 M CYP3A4 - 50% metabolizovaných léků M CYP2D6 - 20% ÜCYP2D9 + CYP2C19- 15 % ÜCYP2D6, CYP2D9, CYP2C19 a CYP2A6 byly prokázány jako funkčně polymorfní Typ metabolismu Extenzivně metabolizující Středně metabolizující Spatně metabolizující Zvlášť rychle metabolizující Metabolismus léku "Normální" metabolizace a optimální přínos standartních dávek léku Snížená metabolizace léku Možnost toxické akumulace a vedlejších účinků při standardních dávkách Omezená nebo žádná metabolizace léku, takže hladiny jsou často toxické. Vysoké riziko vedlejších účinků léku při standardních dávkách. Rychlá metabolizace, takže cirkulující hladiny léku rychle klesají pro terapeutickou úroveň, takže se nedostavuje adekvátní teraputický efekt při standardních dávkách. Metabolismus prekurzom léku "Normální" metabolizace a optimální přínos standartních dávek léku Neadekvátní transformace prekurzom léku do aktivních metabolitů. Redukce účinku standardní dávky Neschopnost transformovat prekurzor léku na aktivní metabolit, takže terapeutický efekt je minimální nebo žádný. Rychlá konverze prekurzoru léku. Toxické hladiny a vedlejší účinky při standardních dávkách léku. á ^H ^^r I ^^ ■ CYP2D6- Metabolizující enzym (dealkylace, hydroxylace) -psychiatrie, kardiológie ■ 160 variant (Ch22) M CYP2C19- protikřečové léky, inhibitory protonových pump, benzodiazepiny, antimalarika 20 variant (Ch10) s funkční nedostatečností (CYP2C19*2 a CYP219*3-splice site defekty, stop kodony) A — I ľ ^> I ■ .^ ^>\ x r^ A I™ /^ J. Fenotyp Alely EM Nejméně jedna a ne více než 2 normální funkční alely SM Jedna alela s redukovanou aktivitou a jedna nulová alela ŠM Dvě nulové alely ZRM Mnohočetné kopie funkčních alel Receptory signálních molekul účastnících se v patofyziologii nemoci ■ G-protein coupled receptors: ■ ß-1 a ß-2 adrenergní receptory ■ Receptor pro cholecystokinin 2 (CCK2) ll Mu opioidní receptor ■ U těchto receptoru byly prokázány polymorfismy, které ovlivňují afinitu Ugandu. Je tedy možno navrhovat podle potřeb takové ligandy, které respektují (individuální terapie) nebo naopak nerespektují (univerzální použití léku) tuto variabilitu. ■ Je také možno navrhovat takové ligandy, které se vážou pouze na mutované varianty genů a inaktivují je (genová terapie) Klinicky relevantní genetické polymorfismy ve vztahu k účinnosti léků disease Treatment Comment ŘďE! eience M3-AML all trans-nXinvic acid Glioma carmustine, BCNU Asthma S lipoxygenase inhibitors ($2 adrenergic agents Depression Imipramine Patients with PLZF/RARA [4] fusion are not responsive to retinoids, Only tumors with CpG [22] methylation of the promoter of the (ŕ-methylguanine DNA methyltiansferase gene respond to treatment willi alkylating substances. ALOX5 promoter geuo- [23] type influences response to neatment; individuals witJi Iwo non wild type alleles show n o response to 5 LOH inhibit oi s, Glyló-allele of fc adren- [24] ergtc receptor is associ atcd will) much strongci broncho dilator desensitisa-tion than Arglô. Fast uictaholiscrs do not [19] leach therapeutic drug levels with normal dosage. Klinicky relevantní genetické polymorfismy ve vztahu k vedlejším ucmkum leku nig IVansporler ABCBI 3433C-T(ĽclU5Ilc} 0.10-0.50 Numerous, including au-liconvulsanrs. protease Id luhtiors. digoiin and others Di Sciences in pJasnia dru£ Concentrin on and efficacy [3.31-3^1] Ďriis1artels "i- phanuucolu^kTil i HpuJíš* --i ■■: eins l ,4/ttSJ 5ľi4'JC-]> Ai£."S9Gly 0.15^0,30 0.25-0.47 (^-blockers Blood piessuie lofteiiii!^ by (Í Mockeis 0S.36] AORR2 AigíóGIy Glu27Gln 0.4 J-0.54 0.07^0.35 ß-agOniStS Bronchodilalion and cardiovascular responses To ß agonisls P7,33) DRD3 SertGly 030-0.70 Anlipsye holies Differential antipsychotic efficacy. iiniipMydiniLc induced tardive dyskinesia and acuieaj» husia 139-41) AUDI Gly460riVp Oj06 0.60 Diuretics Differential antihypcrlen sivc icsponsc and differences in de&ioc of icduc-lifii in nsk for myocardial infanti ion and irtnokc i u hypertensives |42 44| GrVöJ CE25T (creates uri) E2Cysl30and sptice van 0.32 0.76 Diuretics. antidepressants Differential drug efficacy 145,461 AFtfE CysJ76 0.04-0.16 Tacrine. stahns Differential drug efficacy [47-49] E3Cysl30and Argl76 0.60 OS5 e4 Anj3Q*&4 Ajg17G n.oo-n.2* FJ AigSOftGlh (Pact« V Lci^ AtanttoCUM RjiltttgĽii, mal contracep- Inci eased venous ihroni- ptoi] djen> tives boembolism risk Pohyb farmakogenetiky směrem ke klinické praxi ■ Farmakogenomická vs. obvyklá péče ■ Studie dokládající dostatečný stupeň variability k predikci klinické užitečnosti ■ Studie na vhodných populacích, které odpovídají klinickým případům ■ Vylepšení koncepce klinických studií ■ Funkční studie in vitro ■ Sekvenční variabilita kandidátních genů Hodnocení významu genetických faktorů u multigenních nemocí-10 otázek ■ Jak důležité jsou genetické vlivy i nejčastějších forem multigenních nemocí? ■ Jaký je vliv prostředí na vznik nemoci? ■ Které jsou nejslibnější přístupy k determinaci genetických faktoru pro nemoc? ■ Které geny již byly vybrány jako vnímavé? ■ Které cesty přispívají ke genetické vnímavosti pro danou nemoc? ■ Jak mnoho genů se podílí na vnímavosti k nemoci účastní? ■ Jsou nejčastější formy multigenní nemoci asociovány s častou nebo vzácnou genetickou variabilitou v populaci? (hypotéza častá variace/častá nemoc vs. genetický heterogenní model) ■ Proč alely, které jsou asociovány s nemocí, nebyly z populace eliminovány? ■ Jako důležité jsou pro danou nemoc interakce geny-prostředí a geny-geny? ■ Jaké jsou důsledky pro farmakogenetiku? Geny přispívající k vnímavosti ke kardiovaskulárním nemocem GENES MEDIA Ci-f*WfO [•rrwffŘ-!- ADtyt V „ INTIMA C^£_ ^V=ř & Lipoprotein^ gSSS?^ ~ >^t^ trapping ^ ^ p^ ď^grjne^ď fjo« 0^.oxLJDL ,^Mo *»ffamjp»aíory :*in í Muscle š\ I, . | Cells Fqan; Cells V Fatty \A Insulin Resistance ■ H omůtystúl ne H ypertension C oagul ati on Fro Hf&ra rtori -HěoroJtic L es(on Qont o1 ■ r." J ~. ... - ■J Genetické a environmentálni rizikové faktory pro nemoc koronárních tepen Risk factors with a significant genetic component (heritability*1 > Myocardial infarction (25%—60%) Total cholesterol (10%-60%) High density lipoprotein cholesterol (45% 75%) Total triglycerides (40% 80%) Body mass index (25%-60%) Systolic blood pressure (50%-70%) Diastolic blood pressure (50% 65%) Lipoprotein [a] levels (90%) Homocysteine levels (45%) Type 2 diabetes (40% 80%) Fibrinogen (20%-50%) C-re active protein Gender Age Environmental risk factors Smoking Diet Exercise Infection Fetal environment fis intermediálním fenotypem Ms klinickou manifestací nemoci ■s klinickou závažností nemoci ■s odpovídavostí nemoci na léčbu Zdraví čeští dobrovolníci středního věku (41-50 let) Polymorfismus -596 A/G v genu pro IL-6 AA Osoby s HR < 78/min (99) 28 Subjekty s HR > 78/min (71) 8 AG 51 62 Pg=0,006 Pa=0,01 GG 21 30 D Osoby s HR < 78/min (99) D Subjekty s HR > 78/min (71) Genotypy AG+GG uvedeného polymorfismu jsou častější u jedinců s vyšší srdeční frekvencí (OR-4,27, 95% Kl 1,66-10,98, P-0,0009). Vašků A et al. Physiol Res 2003, v tisku Chronické srdeční selhání Asociovaný genotyp 8002 G/A a -3A/-4A EDN-1 Big endotelin D Big endotelin < 0,7 pmol/L (19) D Big endotelin > 0,7 pmol/L (84) Asociovaný genotyp AG3A4A nese 5x vyšší OR pro chronické srdeční selhání ve skupině s nízkou hladinou big endotelinu oproti skupině pacientů s vysokou hladinou: OR = 5,38; 95% Kl = 1,75-16,58; Vašků A et al. Experimental and MolecuR Patholog] P= 0.005 7.T- 230-233, 2002 Chronické srdeční selhání Polymorfismus -790T/G v genu pro MMP-2 Celkový cholesterol Muži s CHF, TC < 5 mmol/l (58) Muži s CHF, TO 5 mmol/l (58) 1 to 100 -. ? 50 ^^_ PS Pa —i 1=0,03 i=0,01 U TT TG GG Muži s CHF, TC < 5 mmol/l (58) 30 34 36 Muži s CHF, TC > 5 mmol/l (58) 10 40 50 Genotypy TG + GG přinášejí 3,59x vyšší OR pro muže s CHF a vyšší I hladinou celkového cholesterolu: OR-3,59; 95% Kl 1,30-9,93; P=0,0( Vašků A et al. Clin Chem Lab Med 41:1299-1304, 2003 Model terapie hypertenze (podle Lindpaintnera, březen 2003) 160 Geny odlišující ALL od AML Ai.i a rvi t ■—- ------- x-: mľ. ,_. "KS -T -O.S Ö O.S 1 " 5 MoľTTi-aliEocJ Expression blikli M H- I ÍT.II 1^35^15 rľycIĹxi O.!- 0223.í ■-T7-A. ÍM7UMJ5 jQiJiKnbií jircilcin HlJ^T.WÍJ liyncln ai^Jvi chäJn C**3a*+4j li.|>.Hb.j.]iiura.^ I] p ľZL5H51 lRl=Jr iJt I 5r>4^5 .■%c>■■-Cľiľ-ľclu>-Mji-ŕ A. diJli^-iJT-njJĽiiiJín:- l"M^J-432-| MHTTM7J LrJMStO771} lkivmyhrpuL«lBC: «ynrJiEUf I L13fri^-GÍ Op 1 h trwf.si^oíi R^r-agilĹn-^i ("Y4J3Ö I 2} H c Lct-ľ>ľ Ihth-tti li Li m ji r ihLeb n p2_S I L?Síiu I 1 1I_-T iE«iilnr ľ&.-i^hhS-^rtj I ""U ETI lO11ROCIOJK C1-9JDC: ÍM^>r >J"l LYNCH LOOľiírl' AjJJp-rrln 1 Mí^if; Jŕij l_L=pcÍD icucplDT í"V|-2riTD5 ■>r 11 Ll-ľ-tJ yiz a n L í>ŕ I 7lfr42 J KJU-4 pn^^TTonr H VOO?ft7j |-*ľ L"t>WT5l J (yr?i cm**cj2:m-> MťTI.I íl_OH34íii .-VlIhis^ (Mäľ7lHJ ÍL-* íľX^SH l *4H1 r=rfhurwin 3v .;iíri.q-IJtfl;i l-CClkn i.M3i77LOs rvi rt.1 í-.t 1 ft-10-yírf 3 } ľ "ľ I "3 I íl: i h-1:-: i n ■ j^ :■ ■ ■Jľ^iTJ í5CÄ_^l I &} ■ _yswi5rrymx= C h-1 l-'Jfrií) Ptii|wrdLn fh4S3ä^3> cľsiLiiLi»f i>li>*jjh:ü;i Metody k analýze farmakologicky relevantních znaků PhaiTtiacoJogic Phannacokinetic studies True assessment of drog and/ormetabolite concentration: not feasible in routine clinicaI selling. Clinical studies Overall assessnientof efficacy and toxicity: usually necessaiy deval- uate relevance of genetic polyniorpbisnis: not suited for individual patients, Birckmical Enzyme activity, receptor Dircci assessment of Function of the jpne picxlijct. function, 01 transporter function deteiminaiions Genetic SNP analysis Fast and simple analysis: mterpietation requires bowlcdgc of the functional effects of SNP: may miss mutations with el&cl on gciitr fonction (i e, potentially low sensitivity), Sequence analysis Provides information on lbe complete exonic sequence and splice junctions; lime consuming; may detect incbani |x>iynwipliistiis(i,e. low specificity). Expression profiling Potentially provides initiation on genetic predispositions: cur lently no data base available: probably most relevant for large! genes ■nul subsqioi signal cascades; may pcimil a direct assessment of drug effects, Validita enzymové aktivity ve srovnání s genetickým vyšetřením bnyzrne activity Gene test (detectipn of the most common mulations) Advances Potentially dcfccb all de- Fast and simple. feels (ie, 100% sensitivity). Disadvantage Time consuming (RBC Sensitivity limited pRspnlion» crcymc icac* (approximately 75%); lion, product detection): analysis of the complete currently not automated: gene is time consuming ictjuiiti experience: false mid expensive, negative result afiei blood transfusion. 471�9481 Analýza SNP ^Hmotnostní spektrometrie ^Fluorescenční metody High-throughput tools for studying gene variation in human populations 735 790 ?95 199 204 209 G t G i G A G S E S 1 G1 GGGGGÚGňG Automated capillary DNA sequencers DNA chips l-** Multiplex SBE Single base extension MALDI-TOF Mass Spectometry MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/lonization-Time Of Flight Mass Spectrometry) Ac cele ratio Detector Kroky minisekvenace M Multiplex PCR genomové DNA ■ Příprava single strand templátu $>] Annealing templátu na primery, vázané na solidní fázi !l Minisekvenace na array ■ Měření inkorporovaných dNTP Minisekvenace pomocí fluorescenčně značených ddNTP-genotypizace polymorfismu na templátové DNA ddCTP ddATP m^ — lluoreť-ccin it —■ ihoduiniiie dďTTP ddGTP ÍT X-Cl p^lytUMptumu T ACGTG ACTG ATGCT T AG CT T CAAT G AG XT GAT GT AG I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ^ G ACT ACG AATCGAAGTT ACTC r „i: j Solid-phase oli^onucleolifk' ' I I v ■ ú * ■ rq M, Tí i_G, ] _JA, Palme r M, Ju >nen E, ] »mann S, P, I JO, Bľ <, j H. Methylenetetrahydrofolate Reductase Genetic Polymorphisms in Patients With Cataract. Am J Ophthalmol. 2005 Nov;140(5):932-934 ■ PURPOSE: Hyperhomocysteinemia is commonly associated with polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene. The level of homocysteine can be lowered by dietary intake of folate. A protective effect of folate supplementation has been reported against cataract. Here we investigate MTHFR polymorphisms in human cataract. DESIGN: Retrospective case-control association study. METHODS: Patients with nuclear (n = 77), cortical (n = 155), posterior subcapsular (n = 119), and mixed (n = 151) cataract, and 187 controls were analyzed for the MTHFR 677C->T and 1298A->C polymorphisms using minisequencing technique. RESULTS: The wild-type MTHFR 677CC/1298AA genotype was strongly overrepresented among cataract cases (P = .003). This effect was most pronounced in the mixed cataract group (P < .001). Hyperhomocysteinemia-associated genotypes had similar frequencies in cataract and control groups. CONCLUSIONS: The previously reported protective effect of folate against cataract is not due to overrepresentation of hyperhomocysteinemia-associated MTHFR genotypes. Instead, the strong predominance of wild-type MTHFR in cataract may suggest impaired DNA synthesis as a cataractogenic factor. Genotypizace polymorfismu v genu pro integrin alfa 2 I fluorescenční identifikací nukleotidů v extendovanem primáři T Ä C Signals for Integrin alpha 2 polymorphism ge noty ping of 96 samples cyiomCiC 1MM0 "..**♦. 4^ i O -----WS» ■WTO4 1DD 10DG ■4» ilclcrozvcDu» CT 7 1ÖW0 f 1— v 100D0G T/T Nttatfv* eftiiifc-^l é T signals Analýza SNP pomocí fluorescenčních metod Category Method Comment ~ŘěE eience Restriction djgtrsi MADGR Homogeneous TaqMan Hy hridi zati on Mismatch distinclion by Polymerasen and Li gase s Anay hybridization assays Minisequencing Roiling circle signal amplification LJghtCycler Oli gonuc leotide assay (OLA) e.g. Affynietiix various methods Can only be used at SNP [36] sites that are part of lesnic-tion sites: not practicable for real large scale: no spe ciflc instj-umentation available, Use of FRĽT to detect [37*38] an ipli fie al ion: a] Ic Jc specific probes (hydrolysis probes, hybridization probes. molecular beacons, scorpions; are used for genotypingi TaqMan suited foi~ high ihroughpui analysis (>10e ^en otypes/w eek )m ligation Not easy to automate: vari- [39,40] ant protocol using FRET (DOL) available. Capable of hi gh t hrou ghpu t [41] analysis. Basically simple protocol [42,43] with many variations including homogeneous detection: a utonialiible, DNA polymerase- [44] driven reaction enabling implication of circularised oligonucleotides under isot hernial conditions. RCA has l>een adopted to soľ d phase arrays for mutation detection (RCA CACHRTT) vtith PCR product* being used as targets. Polymorfismus l/D ACE Odds ratio P ID+DD II Věk (medián, rozsah, roky) 57(21-83) 51 (30-91) 0,002 Betablokátory A/N 106/80 40/11 2,74 pro podávání betablokátorů u II 0,004 Diuretika A/N 161/25 50/1 7,76 pro podávání diuretik u II 0,01 Aspirin A/N 109/77 21/30 0,49 pro podávání aspirinu u II 0,02 Glykémie (medián, rozsah, mmol/l) 6,0(1,6-17,5) 5,5(4,2-16,8) 0,0002 Hladiny TNFa (median, rozsah, umol/l) 70(0,1 -949,5) 2,2(0,1-121,8) Vašků 0,03 A et al.,Člč 2006, vtisku ^t -.Xníkrk Srdeční frekvence (medián, rozsah, min-1) Renin (umol/1) Hladiny TNFa v plazmě (umol/1) Pacienti s doporučenou dávkou 76 (48-95) 3,64(0,02-30,1) 2,7(0,1-279) Pacienti s nižší než 50% dávkou 78 (52-100) 8,13 (0,01-33,7) 2,6(0,1-949) Pacienti bez terapie betablokátory 80(60-130) 9,96(0,1-229) 95,9(0,1-291,6) P 0,0004 0,004 0,001 Vašků A et al., Člč 2006, v tisku I/D ACE II ID D D I D Pg Pa Pacienti s doporučenou dávkou (N= 113) 35 49 29 0,527 0,473 0,005 0,002 Pacienti bez terapie betablokátory(N=91) 11 46 34 0,374 0,626 Pacienti s nižší než 50% dávkou (N=33) 6 17 10 0,439 0,561