Bioluminiscence Bioluminiscence je emise světla z biochemických reakcí, které se objevují v živých organismech. Nejznámější příklad - světluška. Bioluminiscence však je fylogeneticky rozšířený fenomén, který se rozvíjel nezávisle u mnoha živočichů a mikrobů. Bioluminiscence existuje u mnoha organismů: Bakterie Houby Prvoci (Dinoflagelata - obrněnky) Láčkovci (medúza, korál) (Červi) Měkkýši Členovci Ryby Obvyklá hlavně v hlubinách moří, kde obecně všichni živočichové emitují světlo v celém spektru barev Charakteristické rysy všechCharakteristické rysy všech bioluminiscenčníchbioluminiscenčních reakcíreakcí 1.1. Probíhají pouze v přítomnosti kyslíkuProbíhají pouze v přítomnosti kyslíku 2.2. Vždy jsou zapotřebí dva typy látek:Vždy jsou zapotřebí dva typy látek: luciferinluciferin luciferluciferázaáza (lucifer(lucifer znamená přinášející světloznamená přinášející světlo)).. Struktura a vlastnosti luciferázy a luciferinů se liší uStruktura a vlastnosti luciferázy a luciferinů se liší u jednotlivých skupinjednotlivých skupin lumineskujícíchlumineskujících organismůorganismů 3.3. Luciferin je základním substrátem reakce a produkuje světloLuciferin je základním substrátem reakce a produkuje světlo 4.4. LuciferázaLuciferáza katalyzujekatalyzuje reakci.reakci. LuciferimLuciferim + luciferáza+ luciferáza oxyluciferimoxyluciferim ((inaktivníinaktivní) + světlo) + světlo Luciferin je buď:Luciferin je buď: v organismech syntetizovánv organismech syntetizován nebo je dodáván v potravěnebo je dodáván v potravě 5.5. Někdy jsou luciferin a luciferáza navázány a tvoří jednotkuNěkdy jsou luciferin a luciferáza navázány a tvoří jednotku nazvanounazvanou fotoproteinfotoprotein.. AktivitaAktivita fotoproteinufotoproteinu je spuštěna, když určitý iont je dodán doje spuštěna, když určitý iont je dodán do systémusystému Tímto iontem je většinou vápníkTímto iontem je většinou vápník Funkce (účel) BL: Přilákat druhého jedince stejného druhu (sexy svit) Přilákat kořist Odpudit predátora, reakce na šok (aequorea) Kamufláž Houby lákají hmyz ­ pomáhají šířit spory. Někdy svítí mycelium ­ účel ??? Bioluminiscence bakterií Je světlo produkované bakteriemi jako výsledek chemických reakcí Bakteriálním luciferinem je redukovaný riboflavin fosfát, který je oxidován v přítomnosti aldehydu s dlouhým řetězcem, kyslíku a luciferázy. Bakteriální bioluminiscence se objevuje hlavně u mořských, ale i u některých terestrických bakterií FMNH2 = redukovaný riboflavin fosfát = luciferin FMNH2 + RCHO + O2FMNH2 + RCHO + O2 ------------------>> FMN + H2O + RCOOH + hv (490 nm)FMN + H2O + RCOOH + hv (490 nm) RCHO = aldehyd s dlouhým řetězcem (tetradecanal) Vibrio fischeri iluminuje světelný orgán chobotnice Když je živočich vyrušen, emituje luminiscenční oblak. Je to obdoba inkoustu u příbuzných z mělčích vod. Bioluminiscence hub Panellus stipticus Po vysušení houba přestává svítit, po zvlhčení svítí opět. Bioluminiscence prvoků Typický příklad: Rostlinní bičíkovci (řasy ??) Dinoflagellata (= obrněnky) Planktonní bičíkovci hojní v teplých mořích. Luciferin je zde pravděpodobně odvozen od chlorofylu, který má podobnou strukturu. Noctiluca miliaris, N. scintilans, Pyrocystis fusiformis U rodu Gonyaulax, při pH 8 je molekula luciferinu ,,chráněna" před luciferázou pomocí "luciferin-binding protein", když pH klesne, volný luciferin může reagovat a světlo je produkováno. Luciferin obrněnek Pyrocystis fusiformis. Bioluminiscence obrněnek Noctiluca scintilans Bioluminiscence láčkovců Typickým luciferinem pro láčkovce je Coelenterazin Je to obecně nejrozšířenejší mořský luciferin nalezený v mnoha živočišných taxonech Molekula luciferinu se může objevit v komplexu luciferin- luciferáza ­ fotoprotein nazvaný aequorin Modré světlo vyvolané fotoproteinem aequorinem z medúzy Aequorea victoria Někdy žahavci emitují světlo nikoliv přes aequorin, ale přes GFP ­ potom je světlo zelené Aequorea victoria - okraj zvonu Někdy žahavci emitují světlo nikoliv přes aequorin, ale přes GFP ­ potom je světlo zelené Aequorin ­ využití pro analýzu Ca2+ Je fotoproteinový komplex izolovaný z medúzy Aequorea (a jiných mořských druhů). Funkční komplex = 22,000 MW apo-aequorin (protein), molekulární kyslík a luminofor coelenterazin. Když se Ca2+ naváže na komplex, coelenterazin je oxidován na coelenteramide při uvolnění CO2 a modrého světla (469 nm). GFP ­ mechanismus emise světla Pro doplnění: Lumineskující hydroid Obelia (malá medúza) Reaguje podobně jako aequorin na přítomnost iontů vápníku Obelin = evropský příbuzný amerického aequorinu Bioluminiscence korálů Bioluminiscence měkkýšů PHOLASINPHOLASIN PhotoproteinPhotoprotein ofof thethe bioluminescentbioluminescent molluscmollusc ((PholasPholas dactylusdactylus)) ˇ Pholasin is isolated and purified by: ˇ Knight Scientific Limited (UK) Bioluminiscence korýšů Vargulin je luciferin nalezený u garnáta Vargula Tento korýš Vargula má dvě luminiscenční žlázy schopné rychle vystříknout luciferin a luciferázu do mořské vody. Tato luminiscence má za účel vylekat jejich predátory. Bioluminiscence korýšů Vargulin je rovněž používán rybou Porichthys. Zde je přímá souvislost s potravou ­ ryba emituje BL pouze tehdy, přijímá-li potravu nesoucí vargulin. Luciferin a luciferáza vznikají ve zvláštních buňkách nazývaných photocyty. Tyto buňky jsou buď různě rozmístěny ve tkáních organismu, nebo seskupené v jednom specializovaném orgánu, nazývaném photophory. Porichthys. Bioluminiscence světlušek Luciferin světlušek je použit v luciferin-luciferázovém systému, který vyžaduje ATP jako kofaktor. Toho je využíváno v mnoha analytických testech. Celých 96 % oxidační energie se přemění přímo na světlo. Jak světlušky získávají energii? Jsou masožraví. Živí se hlavně plži. Sliny larev obsahují anestetikum, které jim umožňuje poměrně klidné hodování. Svítit dokáží nejen létající samečci a na zemi žijící samičky, ale i larvy. Mnohdy svítí i vajíčka. Světélkování dospělců (,,sexy-svit") umožňuje sblížení jedinců, kteří si způsobem svícení vzájemně imponují. Světlo také napomáhá vymezovat teritorium a upozorňuje i na nebezpečné překážky (pavučina, voda). Regulace emise světla světluškami: Vzplanutí nervové aktivity stimuluje uvolnění primárního neurotransmiteru - octapaminu. To spouští světelný orgán lokalizovaný na zadečku, který obsahuje tisíce fotocytů s organelami obsahujícími luciferin a luciferázu. Ty reagují a emitují světlo, pokud je přítomen kyslík. Ten je dodáván z mirochondrií přítomných na koncích fotocytů. Které faktory kontrolují emisi světla ??? Kyslík proudí do mitochondrií fotocytů. Nějaká látka musí regulovat oxidaci luciferinu a luciferázy v peroxisomech fotocytů, pokud světluška chce/nechce svítit.. (Aprille et al, 2004) - mitochondriální spotřeba kyslíku je konečný kontrolní bod pro odstranění veškerého kyslíku, který dosáhne fotocytů. V odpovědi na neuronální excitaci je uvolňován NO ­ ten inhibuje extrakci kyslíku mitochondriemi. To dovoluje kyslíku oxidovat luciferin. Jak mechanismus funguje ?? Světlo není Kyslík je dodáván ,,lanternovým tracheolárním systémem a je konzumován mitochondriemi fotocytů To způsobuje hypoxii cytoplasmy fotocytů a brání kyslíku, aby dosáhl peroxisomů (organel obsahujících luciferin a luciferázu). ATP produkované oxidativní fosforylací je zapotřebí k formování a akumulaci aktivovaného luciferyl-adenylát meziproduktu (označený jako Luciferin*). Světlo je Neurotransmiter octopamin activuje ,,lantern" NO syntázu (NOS), která produkuje NO. NO difunduje rychle a inhibuje zpracování kyslíku mitochondriemi fotocytů. Kyslík dodávaná tracheolami difunduje do peroxisomů a spouští reakci produkující světlo. Další faktory zapojené do kontroly: Dodávka vzduchu je regulována zavíráním průduchů ­ pouze v odpovědi na stres. Může být také regulována difuze kyslíku skrz tracheoly zaplněné tekutinou. Závěr: NO a mitochondrie fungují jako nejdůležitěkší ,,gatekeepers" pro kyslík. Další příklad - Phrixothrix ­ Railroad worm Arthropoda : Insecta : Coleoptera : Phengodidae Genus: Phrixothrix. U ryb je světlo produkováno BL bakteriemi. Obr. - Photoblepharon palpebratus, s víčkem svého BL orgánu otevřeným (vlevo) a zavřeným (vpravo). Světlo je produkováno spojitě, ale jeho viditelnost do okolí je kontrolována rybou. Funkce: * Lákání kořisti ˇ Signálování jiným jedincům ˇ Zmatení predátorůconfusing potential predators Využití bakteriálníVyužití bakteriální luminiscenceluminiscence Bioluminiscenční bakterie Nyní známe 11 druhů 4 rodů Vibrio, Photobacterium, Shewanella (Alteromonas) and Xenorhabdus (Photorhabdus) Které produkují viditelnou BL Jedná se především o bakterie v mořské vodě, některé jsou i terestrické (pouze rod Photorhabdus) Mohou se objevovat samostatně volně existující, jako saprofyté, komenzálové, parazité živočichů a symbionti ve světelných orgánech Vždy zahrnují i druhy (izoláty) bez luminiscence (Meighen & Dunlap 1993) BL bakterieBL bakterie > Gram(> Gram(--)) >> Emisní vlnová délkaEmisní vlnová délka: 490 nm: 490 nm >> NesouNesou luxlux operonoperon který kontroluje emisikterý kontroluje emisi světlasvětla Bioluminiscence bakterií je vyvolána reakcí molekulového kyslíku s redukovaným flavin mononukleotidem (FMNH2) a aldehydem za vzniku FMN, vody a mastných kyselin za účasti luciferázy. Luminiscence je energeticky náročná (vysoká spotřeba ATP luciferázou), vlnová délka emitovaného modrozeleného světla je 490 nm Produkce luminiscence je těsně spjata s buněčným metabolismem a je tedy odrazem viability bakterií Vzestup intenzity světla během růstu BL bakterií odráží syntézu pěti proteinů kódovaných lux operonem Bioluminiscenční (lux) geny jsou podobné pro všechny BL bakterie. Zahrnují 5 genů: lux A a lux B jsou zodpovědné za alfa a beta podjednotky luciferázy lux C, D a E kódují komplex reduktázy mastných kyselin potřebné pro generování a recyklaci mastných kyselin na aldehyd (decanal). Quorum sensing Dva regulační geny: I a R Gen I řídí syntézu N-acyl homoserin laktonu (HSL), signalizační molekuly známé jako autoinduktor potřebný pro aktivaci lux genů. Gen R kóduje syntézu N-acyl HSL receptoru - transkripčního faktoru odpovídajícího na N-acyl HSL signál. Receptor má DNA binding doménu a N- acyl HSL binding doménu. Hustota bakteriální suspenze je potřebná k dosažení kritické koncentrace autoinduktoru. Poté dojde k vazbě luxR produktu a transkripci luminiscenčních genů. FactorFactory ovlivňujícíy ovlivňující in vivoin vivo reareakcikci > genetic> genetickáká kkontrolontrolaa >> kkoncentraoncentracece rozpuštěného kyslíkurozpuštěného kyslíku >> koncentracekoncentrace Mg2+ a Ca2+ ionMg2+ a Ca2+ iontůtů >> intracelulintracelulárníární energetická rovnováhaenergetická rovnováha FaFakktortoryy ovlivňující bakteriální BL aktivituovlivňující bakteriální BL aktivitu > optim> optimálníální pHpH kolemkolem 77 >> změny v koncentracizměny v koncentraci NaClNaCl >> absorpce světla silným zabarvením vzorkuabsorpce světla silným zabarvením vzorku >> vysoká spotřeba kyslíku vzorkemvysoká spotřeba kyslíku vzorkem DůležitéDůležité ChemChemickéické, fyzikální a biologické, fyzikální a biologické toxikantytoxikanty, které, které ovlivňujíovlivňují -- respiraci buněkrespiraci buněk -- syntézu proteinůsyntézu proteinů -- syntézu lipidůsyntézu lipidů -- integritu buněkintegritu buněk -- a zvláště funkce buněčných membrána zvláště funkce buněčných membrán mají silný vliv namají silný vliv na in vivoin vivo BLBL 0.250.7Diesel fuel (TPH) 0.10.2Kerosene (TPH) 0.30.3Bromoform (THM) 0.150.3Fluoranthene (PAH) 0.10.125Aroclor 1232 (PCB) 0.0080.01Aroclor 1254 (PCB) 1.2512,4-D 0.10.2Aldrin 0.0030.007Pentachlorophenol (PCP) 0.060.12DDT 0.150.2Chlordane 0.31Chlorpyrifos 0.030.07Mercury (II) 0.010.1Nickel (II) 0.20.1Lead (II) 0.0070.02Copper 0.060.06Cadmium (II) EC50 @50-60 min EC50 @20-30 minToxicant EC50 ­ Efektivní koncentrace (ppm - parts per million) toxikantů, které působí 50% inhibici luminiscence ApliAplikacekace metodmetodyy >> odpadní vodyodpadní vody >> čerstvá vodačerstvá voda ((povrchová i spodnípovrchová i spodní)) >> slaná a brakická vodaslaná a brakická voda >> sedimenty a výluhysedimenty a výluhy >> další vzorky rozpustné ve vodědalší vzorky rozpustné ve vodě Výhody analýzVýhody analýz >> snadno proveditelnésnadno proveditelné >> finančně nenáročnéfinančně nenáročné >> vysoce citlivévysoce citlivé >> široké spektrum aplikacíširoké spektrum aplikací >> eticky akceptovatelnéeticky akceptovatelné >> toxicitu je možno vztáhnout i na vyšší organismytoxicitu je možno vztáhnout i na vyšší organismy >> malý objem analyzovaného vzorkumalý objem analyzovaného vzorku >> krátká doba provedeníkrátká doba provedení == rychlé výsledkyrychlé výsledky >> statisticky spolehlivéstatisticky spolehlivé ((vysoký počet testovanýchvysoký počet testovaných organismů)organismů) Mezinárodní normyMezinárodní normy Bestimmung der Hemmwirkung von Abwasser auf die Lichtemission von Photobacterium phosphoreum; Leuchtbakterien-Abwassertest mit konservierten Bakterien, DIN 38 412-L34 (L341) Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test), ISO/CD 11348 Potřebné vybaveníPotřebné vybavení (přenosný) luminometr kyvety nebo mikrotitrační destičky kultura bakterií NaCl čistá (redestilovaná) voda PProvedenírovedení testutestu Připrav (odeber) vzorek Nastav salinitu a pH (pokud je to nutné) Připrav si několik ředění vzorku Připrav kulturu bakterií, stabilizuj ji Pipetuj bakterie do zkumavek Změř BL aktivitu Přidej vzorek a inkubuj (podle bakt. kultury 15 nebo 30 minut nebo i déle) Změř BL aktivitu po inkubaci Vypočítej výsledky (EC50) 0 5 10 15 20 25 The influence of CdCl2 on the CL of Photobacterium leiognathi CL (RLU) control 0.03 ppm 0.06 ppm 0.12 ppm 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 10 100 1000 Vibrio fis cheri control CdCl2 Time (min) CL (RLU) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 10 100 1000 Photobacterium leiognathi control CdCl2 Time (min) CL (RLU) Photorhabdus (=Xenorhabdus) luminescens: ˇ G- tyčkovitá, bioluminiscenční, pohyblivá bakterie, velmi variabilní, velikosti v rozmezí od 2 x 0,5 do 10 x 2 m s příležitostnými filamenty délky do 30 m ˇ dřívější označení Xenorhabdus luminescens bylo změněno na základě fenotypové charakteristiky a příbuznosti DNA v roce 1993 vytvořením nového rodu Photorhabdus ˇ žije volně v půdě nebo v symbióze s EPN ˇ luminiscence P. luminescens je při 37°C 1000 x menší než u Vibrio harveyi při 25°C ˇ lux operon je luxCDABE, tj. minimální jaký funguje Systematika rodu Photorhabdus: určeno na základě příbuznosti DNA hybridizací DNA (Fischer-Le Saux et al.1999) P. luminescens - 5 poddruhů: ssp. - luminescens - akhurstii - laumondii - kayaii - thracensis P. temperata - jeden poddruh: ssp.- temperata P. asymbiotica - jeden poddruh: ssp. - australis Typové kultury rodu Photorhabdus z CCM Brno: Photorhabdus asymbiotica CCM 7074T - izolace z lidského poranění, Texas Photorhabdus luminescens ssp. akhurstii CCM 7075T - izolace z Heterorhabditis indica, Guadeloupe Photorhabdus luminescens ssp. laumondii CCM 7076T - izolace z Heterorhabditis bacteriophora, Trinidad a Tobago Photorhabdus luminescens ssp. luminescens CCM 7077T - izolace z Heterorhabditis bacteriophora, Australia Photorhabdus temperata CCM 7078 T - izolace z Heterorhabditis megilis, Rusko P. luminescens s s p. laumondii CCM 7076 0 20 40 60 80 100 0 50 100 Time (min) bioluminescence (mV) P. luminescens s s p. akhurstii CCM 7075 0 20 40 60 80 100 0 50 100 Time (min) bioluminescence (mV) P. temperata CCM 7078 0 500 1000 1500 0 50 100 Time (min) bioluminescence (mV) Photorhabdus s p. CCM 7002 0 20 40 60 80 100 0 50 100 Time (min) bioluminescence (mV) P. luminescens s s p. luminescens CCM 7077 0 20 40 60 80 100 0 50 100 Time (min) bioluminescence (mV) P. asymbiotica CCM 7074 0 100 200 300 400 500 0 50 100 Time (min) bioluminescence (mV) 25°C Photorhab dus s p. CCM 7002 0 20 40 60 80 100 0 50 100 Time (min) bioluminiscence(mV) P. luminescens s s p. luminescens CCM 7077 0 20 40 60 80 100 0 50 100 Time (min) bioluminiscence (mV) P. luminescens s s p. laumondii CCM 7076 0 20 40 60 80 100 0 50 100 Time (min) bioluminiscence (mV) P. luminescens s s p. akhurstii CCM 7075 0 100 200 300 400 500 0 50 100 Time (min) bioluminiscence(mV) P. asymb iotica CCM 7074 0 100 200 300 400 500 0 50 100 Time (min) bioluminiscence(mV) P. temperata CCM 7078 0 500 1000 1500 0 50 100 Time (min) bioluminiscence (mV) 37°C