1
Bioluminiscence a jejBioluminiscence a jejíí
praktickpraktickéé vyuvyužžititíí
2
Luminometrické metody
Luminofory jsou oxidovány RMK. Při návratu do
základního energetického stavu emitují fotony. Jejich
detekce je možná pomocí luminometrů nebo
scintilačních spektrofotometrů.
Nejčastěji používané luminofory:
- Luminol
- Lucigenin
- Izoluminol
- Pholasin
3
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
Na principu luminofory zesíleného chemiluminiscenčního
stanovení reaktivních kyslíkových metabolitů (RKM) je
založeno měření oxidativního vzplanutí fagocytů a
antioxidační kapacity biologických tekutin.
Další skupinu tvoří metody založené na reakci ATP s
luciferinem katalyzované luciferázou.
Mikroorganismy produkující světlo jako součást svého
základního metabolismu jsou využívány v toxikologii.
4
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
Luminometrické metody založené na stanovení RKM
Princip metody
luminol + oxidant   - aminoftalát + N2 + světlo (425
nm)
Využití metody
studium fagocytózy
měření antioxidačních vlastností (tělních) tekutin
5
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
Studium fagocytózy pomocí chemiluminiscence
Chemiluminiscenční analýza je senzitivní technika, která měří
produkci volných kyslíkových radikálů v malých objemech
krve (mikrolitry). Použití různých luminoforů umožňuje odlišit
jednotlivé radikály, jejich intracelulární a extracelulární tvorbu.
Použitím různých aktivátorů a inhibitorů lze sledovat defekty
procesu opsonizace a chemotaxe, funkčnost NADPH oxidázy
a ostatních enzymů spojených s oxidativním vzplanutím,
expresi a funkčnost různých buněčných receptorů.
6
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
NADPH
oxidáza
NADP+
(O2
-ˇ, H2O2, OHˇ)
O2
- ˇ
O2
NADPH + H+
luminol + oxidant  -aminoftalát + N2 + světlo (425 nm)
7
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
Studium fagocytózy pomocí chemiluminiscence
Materiál
plná krev
plasma obohacená o leukocyty (tzv. buffy coat)
izolované PMNL
Indikace
imunologie (chronická granulomatóza, nedostatečnost komplementu,
defekty chemotaxe
hematologie a biochemie (neutropenie, aktivita myeloperoxidázy)
fyziologie (poruchy opsonizace)
mikrobiologie (vliv bakteriálních peptidů, buněčných stěn, endotoxinu)
farmakologie a toxikologie (účinek léčiv a toxickýxh látek)
8
Oxidativní vzplanutí fagocytů
Aktivátory fagocytů Místo působení
osponizované částice (OZP) povrchové receptory
fMLP povrchové receptory
PMA proteinkináza C
vápníkový ionofor A23187 Ca2+ PKC
9
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
Měření antioxidační kapacity biologických tekutin
Reaktivní kyslíkové metabolity jsou tvořeny při tepelném
rozkladu vybraných sloučenin. Po přidání vzorku obsahujícího
antioxidanty CL signál vymizí, přičemž doba vymizení CL
signálu je přímo úměrná antioxidační aktivitě vzorku.
10
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný
luminol vs. isoluminol
Streptococcus mutans
11
RozliRozliššeneníí mezi RMK a RMDmezi RMK a RMD
antioxidanty
NO donory (sodium nitropruside, SIN-1)
analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L-
NNA)
12
SystSystéémy generujmy generujííccíí RMKDRMKD
xanthin/xanthin oxidáza O2
-ˇ
peroxid vodíku + ionty přech.kovů ˇOH
peroxid vodíku H2O2
ABAP ROOˇ
SIN-1 ONOO-
buněčné systémy (fagocyty)
13
Metoda TRAPMetoda TRAP
Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter
stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě
rozpustných antioxidantů
referenční vzorek: trolox
14
Metoda TRAPMetoda TRAP
2,2`-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride
2,2`-azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride
15
Metoda TRAP v lipidovMetoda TRAP v lipidovéé ffáázizi
2,2`-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)
16
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
Měření antioxidační kapacity biologických tekutin
Materiál
plasma
sérum
sliny
semenná tekutina
Indikace
riziko oxidativního poškození tkání
riziko odvržení štěpu po transplantaci
17
LuminometrickLuminometrickéé aplikace v biologii a medicaplikace v biologii a medicíínněě
50% peak
CL
Čas
Přidání vzorku