Luminiscence aplikace v metodách molekulární biologie, imunologie a biochemie Luminometrické aplikace v biologii a medicíně • Hematologicka a imunologická vyšetření • Hygienický monitoring (mikrobiologická kontaminace) • Toxikologické testy • Molekulární biologie (reportérové geny) Množství komerčních testovacích souprav, které jsou využívány v klinické biochemii, imunologii, toxikologii, virológii, endokrinológii Diagnostika: Thyroidní funkce, fertility, poškození myokardu, anémie, koncentrace léčiv, monitorování odbourávání léčiv, rakoviny, infekčních nemocí. Rozdělení luminiscenčních metod podle principu 1. ATP assays (sterility tests, proliferation, toxicity) 2. Luminescence-based imunoassays (WB and ELISA) 3. Gene expression 5 Luminometrické metody založené na měření ATP Princip metody: luciferáza ATP + luciferin + 02-----> oxyluciferin + AMP + PPi + C02 + Touto metodou se stanovuje buď přímo množství ATP ve zkoumaném vzorku nebo aktivita enzymů nebo substrátů, které jsou spřaženy s tvorbou nebo spotřebou ATP (např. stanovení ß-podjednotky kreatin kinázy používané v diagnostice akutního infarktu myokardu) ATP Concentration Curve ATP Concentration Curve 5000 ■ 4000 ■ R L 3000 ■ U 2000 ■ 1000 ■ 0 20000 40000 G0000 80000 100000 ATP (attomoles) Linear Regression y = a * x + b a=0.04905 b=36.78 R =1.000 R!=1.000 err=10.44 10-lS 10-"10-|D 1ÍT* 10-" Iff* Iff6 10-J 10-* ATP [M] ATP Detection limits ATP limit of detection 100 attomol/well Dedicated luminometer (i.e. Bio-Tek Clarity) is 10 attomol/well. Využití metod založených na stanovení ATP Měření ATP v bakteriálních, rostlinných a živočišných buňkách Pomocí CL metody za využití luciferazy se stanovuje ATP, které je obsažené ve všech živých buňkách. Množství ATP lineárně koreluje s počtem živých buněk. • stanovení buněčné proliferace a cytotoxicity (např. sledování sensitivity bakterií k antibiotikům, sledování cytotoxicity proti nádorových léčiv apod.) • monitorování hygieny pracovního prostředí (např. potravinářství) • měření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích a fermentorech Monitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů Výhody oproti konvenčním mikrobiologickým postupům: Rychlost a jednoduchost, vysoká sensitivita a přesnost, stanovení celkové biologické kontaminace (ta může pocházet z reziduí výrobků, z kontaktu s lidskou pokožkou nebo z mikroorganismů). Monitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů CL stanovením ATP - ster z pracovní plochy Měření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích Materiál • vodné roztoky Indikace • mikrobiální znečištění pitných a užitkových vod • mikrobiální znečištění potravinářských výrobků Měření množství mikroorganismů ve vodných roztocích Stanovení proliferace eukariotických buněk Stanovení na základě měření obsahu ATP ve vzorku. Rychlá a sensitivní alternativa k metodám využívajícím radioktivně značené prekursory tvorby DNA (např. 3H-tymidin). Uváděná sensitivita řádově 100 buněk. ApoSENSORTM ADP/ATP Ratio Assay Kit Biovision Kit utilizes CL detection of the ADP and ATP levels for a rapid screening of apoptosis, necrosis, growth arrest, and cell proliferation simultaneously in mammalian cells. Increased levels of ATP and decreased levels of ADP have been recognized in proliferating cells. In contrast, decreased levels of ATP and increased levels of ADP are recognized in apoptotic cells which further much more pronounced in necrosis than apoptosis. ADP level is measured by its conversion by ADP Converting Enzyme to ATP that is subsequently detected using the same reaction. Interpretation of Results: Cell Fate ADP Level ATP Level ADP.'ATP Proliferaton Very Low High Very Low ■Srowlh Arrest Ldw Slig"-|y ncreased Low Apoptosis High Low Hig- NecrDE-s Much -lig "er Ve"v Ldw Much H q her Imunodi ELISA, Western blotting, Arrays • Secondary Ab labeled with AP or HRP • Substrate for Conjugate produces AnlirjfrTi luminescence nostika Immunoassay Schemes Employing an Alkaline Phosphatase Label for Detection with CSPD® Substrate AlksJine Phocphata» Libeled Antibody Am body Sandwich Immunoassay Direct capture of antigen by bound antibody and detection of antigen by AP labeled antibody i i ^ Lialad Antbody ^^ľSľ laaJai Monoclonal Antbody Direct capture of monoclonal antibody by bound antigen and detection of monoclonal antibody by AP labeled antibody Monoclonal Screening Ataina Fhoscbsrtata L=balid ArtiEdy Competitive Assay Alkbine Phospholb» Lsbalad Antigan Antibody Competitive Assay ^^Vight Competition between bound antigen and solution antigen for AP labeled antibody Competition between AP labeled antigen and unlabeled ant igen for bound antibody Značení křenovou peroxidasou - substráty 1. Detekce založená na luminolu (a příbuzných luminoforech) Luminol a jeho analogy jsou ko-substrátem pro HRP. V přítomnosti oxidantu se luminol oxiduje např. peroxidem vodíku. Intensita a trvání CL signálu jsou úměrné aktivitě HRP. V kitech jsou používány enhancery CL (např. luciferin) a naopak látky potlačující pozadí. 2. Detekce založená na akridanových esterech Akridanové estery emitují v přítomnosti HRP a peroxidu vodíku intenzívní glow reakci. Značení alkalickou fosfatasou - substráty 1 Dioxetany Stabilizované adamantyl 1,2-dioxetanové substráty pro alkalickou fosfatasu (např. AMPPD, CSPD® nebo CDP®-Star) představují jednoduchou a rychle reagující assay pro alkalickou fosfatasu. Detekční limit - 1 zmolů (= 603 molekul enzymu) o—o esrsi, Alkaline á Phosphatase o—o OCH, AMPPD (stable) AMPD" Metastable Intermediate (T1/2 2-30 min) 2 Akridan-enolfosfáty Detekční limit - 305 zmolů enzymu + ^* ,OCH, LIGHT Značení glukoso oxidasou Využívá glokoso oxidasu jako enzymovou značku. Enzym produkuje peroxid vodíku. Jeho tvorba je analyzována systémem isoluminol-peroxidasa. Western-blotting Vyblokování nespecifických vazebných míst Inkubace s primární protilátkou proti námi sledovanému proteinu Inkubace se sekundární protilátkou značenou křenovou peroxidázou (HRP) Vizualizace WB pomocí CL • Substráty od různých firem lišící se citlivostí • fotografický film případně ultrasenzitivní kamery Příklad: no LPS _________LPS (0,1ug/mL)______ 0 0 10 25 50 100 QUE(uM) ß-actin Gene and protein arrays TranSignal™ Transcription Reporter Array Typical results • TranSignal™ Transcription Reporter Array A- B. 1234 5 o 123456 § * i • • • ft i • t: ■ ftll 1 1» ft t ft ft ft [M___il • c • ft ft ft ft ft ft ft « ti ft D i # ftf ft f i • • 3 • E * ft i- * ft ft # F f | c. 12 3 4 5 6 A B C D E F G H : Reporter gene assay Princip spočívá ve využití kódující sekvence luciferazy jako reporteroveho genu pro monitorování aktivity promotorů v kontrole genové exprese. Konstrukt DNA obsahující kódovací oblast pro luciferázu kombinovanou se sekvencí s testovanou schopností genové regulace se vnese do studovaných buněk. Po inkubaci se měří výsledek exprese daného reporteroveho genu jako ukazatel účinnosti testovaného promotoru. o ERK c-Fos ERK signaling to c-Fos and AP-1 activation AP- Reporter systems to study how signaling pathways regulate transcription Response Element — TATA Reporter Gene AP-1 Luciferase CRE SRE SRF P53 GFP B-Galactosidase CAT NFkB rPbla SEAP SV4 0 3'-splice si1e/SV40 pAV-i ampidllin cis-Reporler Plasmids \ \ (lucif erase reporter) 1 / / pUC ori LUC^ \^-enhoncer element Metody transfekce DNA-Calcium Phosphate Coprecipitate Luciferase reporter systems to study how signaling pathways regulate transcription ( ) Reporter systems Firefly Luciferase Monomeric enzyme of 61kDa catalyzes a two-step oxidation reaction to yield light, usually in the green to yellow region. The gene encoding firefly luciferase (lue) is a monomer that does not require any post-translational modifications; it is available as a mature enzyme directly upon translation from its mRNA. Renilla Luciferase Monomeric enzyme 36kDa that catalyzes the oxidation of coelenterazine to yield coelenteramide and blue light. Click Beetle Luciferase Click beetle and firefly luciferase belong to the same beetle luciferase family. What makes the click beetle unique is the variety of luminescence colors they emit. Complementary DNAs cloned from the ventral light organ encode four luciferases capable of emitting luminescence ranging from green to orange (544-593nm) such as a red luciferase (611nm) and two green luciferases (544nm each). Single & Dual reporter assay Single-Reporter Assays Assays based on a single reporter provide the quickest and least expensive means for acquiring gene expression data from ce Is. Dual-reporter assay The most commonly used dual-reporter assay is based on combining the chemistries for firefly and Renilla luciferases. These luciferases use different substrates and thus can be differentiated by their enzymatic specificities. The method comprises adding two reagents to each sample, with a measurement of luminescence following each addition. Addition of the first reagent activates the firefly luciferase reaction; addition of the second reagent extinguishes firefly luciferase and initiates the Renilla luciferase reaction. Dual-reporter and dual-color assays allow the user either to measure expression of two different reporter genes or one reporter gene and cell viability. In all cases, the assays allow both measurements to be made sequentially from each sample. Dual reporter assay A HO. rv" X d-Luciferin Rrefly Luciferase + o2 ATP Mg" Oxyluciferin PPi + AMP CO2 _ fenilla ^2 Luciferase + co2 light 560 nm r light 480 nm Coelenterazine Coelenteramide Benefits of a dual assay i) reducing variability that can obscure meaningful correlations ii) normalizing interfering phenomena that may be inherent in the experimental system iii) normalizing differences in transfection efficiencies between samples. Glow Luminescent Firefly Luciferase Signal Firefly Luciferase Concentration Curve 100000 -, 12 deprotonates the intermediate, which decomposes and emits light. Light emission is measured in a luminometer (step 3). o o © • ^^J light light í, • ß-Galactosidase i activated intermediate Secreted human placental alkaline phosphatase activity (SEAP) detection The new fluorescent Great EscAPe SEAP Assay The original chemiluminescent Great EscAPe SEAP Assay MUP Subs date SEAP reporter is secreted into the medium Ů v3 ds^^^^k * CSPD Subs U ale ♦ J0^t< Ewcitition at -Í60 nm ■ F luorescence at 440 nm LIGHT ^frmy^ Luminescence Assay Systems Simpler. Brighten Smarter* Half-life (hoara] Sensitivity Phenol Sed Sensitivity Automatable Moderate Moderate Moderate As little as 5 cells/well Moderate Plate Format racking Low Low _Low ■ N/A Moderate Homogeneous Assay Yes Yes Yes Yes Yes Instrumentation TbpCount* & MicroBeta™, EnVision™ & Fusion™ TopGount & MicroBeta, EnVision & Fusion. ViewLux™ k IrnageTrak™ TopGount & MicroBeta, EnVision & Fusion, ViewLux & IrnageTrak TopGount & MicroBeta, EnVision & Fusion, i ViewLux TopGount & MicroBeta, EnVision & Fusion, & ViewLux * f telíte is not available in the U.S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) For monitoring protein-protein interactions, where a fusion Drotein is made using the bioluminescent Renilla uciferase and another protein fused with a fluorescent molecule. Interaction of the two fusion proteins results in energy transfer from the bioluminescent molecule to the fluorescent molecule, with a concomitant change from blue light to green light. Další využití CL Uvnitř svítící tyčinky je zatavená skleněná ampule s peroxidem vodíku. Ten působí jako oxidant v reakci emitující světlo. Během reakce dochází k následujícím pochodům: 1. Oxidace oxalátového esteru peroxidem vodíku 2. Dekompozice dioxetan-dionového meziproduktu 3. Relaxace fluorescenční barvičky Reakce je spuštěna rozbitím skleněné ampule 1,2-dioxetane-3,4-dione je molekula s vysokou energií 0 n /=^ .OH / HO .OH ^^ o-o I 20 = C = 0 Reaguje s barvičkou uvnitř tyčinky (většinou je to difenyl anthracen) a barvička je excitována. Při návratu do základního stavu jsou emitovány fotony. c—c 2 O^C^C Theirtermediate decomposes into two carbon dioxide molecules DYE11 kv dye The fluor es cer is ex cited; light is given off as the excited state returns to the ground state Další využití CL Kriminalistika: hemoglobin obsahuje železo. Využití v detekci krevních skvrn. Shrnutí na příkladu BioThemal ^ PRODUCT SELECTION GUIDE Select you r type of application X C e II counting, biomass 3lS^y.^. cytotoxicity arc ce I p'olreratior I Go tn chart 1 Enzymesand metabolites e.g. kin j ese-, mitochondrial ATP production Goto chan 2 Luciferase reporter gene assays Gc 1o chart 3 I ImniLioassays us-ing lucrerase or ATP producing enzym es as label 1 Hygiene cnnlrnl of surfaces or iquids Go to chart 4 244-441 ATP Hygiene Kit HS X SanoleE. with rranmalian cells and with extracel u ar ATP _l~ Microbial cells e.g. sacteria Chsrt 1 Cell counti-g, i-ioiiass anc c"^cloxici:ycell prol ass-ays '= ration I Sail des v/'r.hDu: rianrrnalian cells, and with BKtracellu ar ATP 26M12 MicrcbialATPKlHS 1 Samples. wi:ho.,t Tianrnr a an cells, and wrthcul extraoe lular ATP 269-111 In trace lularA-p Kit HS 266-311 ATP Bicrrass K 1 Mannralian cells e.g. cell cu ture X I Low or moderate cell densities, cr lun inom etersw til reagent dispensers 1 High cell denE-iles or high A~-as-e levels anc ..nrinonrelers w1hou1 reagent dispensers 155-Ů5D CelularA-PKitH^S 1&&^4-Cell Viability K 1 SL Charl 2 Enzymes and metabolites. e.g. kinases, mitochondrial ATP production I X React en s poss I; e tc couple tc ATP formation or degradation, e.g. kinases and their substrates or milochondrial ATP prcductior 1 N c 03V c u s reaction thai can be coupled 1o ATP formation d r degradation 144-041 ATP Kit SL Consult BioThema for suggestions Chart3 Luciferase reporter gene assays £ <10Q in vitro assays per day Lun7inorneterwith or without dispenser 434-OU1 Luciferase Assay Kit >10Q in vitro assays per day I L urn in o meter without dispenser Lum no meter with d spenser 484-102 Luciferíase Assay Kit HTS 1 in vivo assays of uciferase 484-1D3 Luciferase Assay Kit HTS CCD camera BT11 D-luciferin Chart4 Immunoassay I 1 Biotinylated luciferase cousled to an antibody via streptavidin 1 ATP producing enzyme coupled to an antibody 484-001 Luciferase Assay Kit SBLA-001 S t re ptavid i n -b btinylated lu cife rase 144-041 ATP Kit SL BioThemal