Kapalinová chromatografie - LC • Fyzikálně-chemická metoda dělení kapalin (roztoků) využívající rozdělování složky mezi dvě nestejnorodé fáze, nepohyblivou (stacionární) a pohyblivou (mobilní), přičemž pohyblivou fází je kapalina. – DIFUSNÍ KOEFICIENTY O 5 ŘÁDŮ MENŠÍ NEŽ V GC • malý vliv molekulární difuse, velký význam odporu proti přenosu hmoty v mobilní fázi, PROBLÉM TURBULENCÍ MOBILNÍ FÁZE • GIDDINGSOVA TEORIE • LLC a LSC, dále GPC, IEC • TECHNIKY SLOUPCOVÉ CHROMATOGRAFIE – systém otevřený – nízkotlaký - Low (Medium) Pressure Liquid Chromatography – systém uzavřený – vysokotlaký - High Performance Liquid Chromatography Kapalinová chromatografie • TEORIE LLC (kapalinová rozdělovací) – kapalná mobilní i stacionární fáze (zakotvená na tuhém nosiči) – OBĚ KAPALINY NEMÍSITELNÉ • obtížné splnit - řešení CHEMICKY VÁZANÉ stacionární fáze • poměr objemů V[m]/V[s] posunut ve prospěch mobilní fáze - pro retenci látek - NUTNÁ ODLIŠNÁ POLARITA OBOU FÁZÍ • CHEMICKY VÁZANÉ stacionární fáze - obvykle NEPOLÁRNÍ – MOBILNÍ FÁZE - POLÁRNÍ » tzv. OBRÁCENÉ FÁZE („reversed-phase“) Kapalinová chromatografie • STACIONÁRNÍ FÁZE pro LLC – chemicky vázaná stacionární fáze - nosič - SILIKAGEL • PORÉZNÍ ČÁSTICE NEPRAVIDELNÉHO TVARU • PORÉZNÍ ČÁSTICE KULOVITÉHO TVARU – komerčně dostupné silikagely s definovanou velikostí částic • SILANOLOVÉ SKUPINY - Si-OH NA POVRCHU ČÁSTIC – REAKCE S MODIFIKÁTOREM » např. OKTADECYLTRICHLORSILAN • AMINOPROPYLOVÉ SKUPINY - (CH[2])[3]-NH[2] NA POVRCHU ČÁSTIC – REAKCE S MODIFIKÁTOREM - TVORBA AMIDŮ Kapalinová chromatografie • STACIONÁRNÍ FÁZE pro LLC – chemicky vázaná stacionární fáze - nosič - SILIKAGEL • odstranění zbylých -OH skupin trimethylsilylovými skupinami • funkční modifikace sorbentů – uhlovodíkové skupiny (řetězce) - oktadecyl, fenyl, oktyl atp. – nitrily -C-oN, dioly, aminy – účelové modifikace sorbentů - makrocyklické látky, opticky aktivní látky atp. – makroporézní gely organických látek - uhlovodíků • funkční skupiny přímo na matrici gelu Kapalinová chromatografie • MOBILNÍ FÁZE pro LLC – v RP-LLC - obvykle polární • ALKOHOLY - methanol, ethanol, propanol, isopropanol • NITRILY - acetonitril • ETHERY - tetrahydrofuran, dioxan, diethylether – mnohdy ve směsi s vodou, směsi i více rozpouštědel • ŘADA DLE ELUČNÍ SÍLY – větší eluční síla U kratší retenční časy – voda - methanol - acetonitril - tetrahydrofuran - aceton • VHODNÁ NÍZKÁ VISKOSITA • VHODNÁ TRANSPARENTNOST V UV OBLASTI Kapalinová chromatografie • SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC – na nepolárních stacionárních fázích - nejvíce zadržovány n-ALKANY • RETENCE ROSTE SE STOUPAJÍCÍ MOLEKULOVOU HMOTNOSTÍ – méně zadržovány - AROMÁTY, HALOGENOVANÉ UHLOVODÍKY – ještě méně zadržovány (v řadě) - ethery, nitroderiváty, estery, aminy, amidy, karboxylové kyseliny, sulfokyseliny – retence polárních látek velmi malá - lze ovlivnit volbou pH* – retence iontových látek (solí) - prakticky nulová - lze ovlivnit volbou pH* Kapalinová chromatografie • SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC – vliv pH* na změnu kapacitních poměrů • V ALKALICKÉM PROSTŘEDÍ POTLAČENA IONIZACE BAZÍ - zvýšení jejich retence • V ALKALICKÉM PROSTŘEDÍ ZNAČNÁ DISOCIACE KYSELIN - omezení jejich retence • V KYSELÉM PROSTŘEDÍ POTLAČENA DISOCIACE SLABÝCH KYSELIN - zvýšení jejich retence • V KYSELÉM PROSTŘEDÍ PROTONACE BAZÍ - omezení jejich retence Kapalinová chromatografie • SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC – vliv pH* na změnu kapacitních poměrů Kapalinová chromatografie • SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC – vliv pH* na změnu kapacitních poměrů Kapalinová chromatografie • TEORIE LSC (kapalinová adsorpční) – interakce složek vzorku v mobilní fázi s adsorbentem (tuhou stacionární fází) • ADSORBENT - kulovité částice - AE ~ 10 μm • adsorpční distribuční konstanty ^– obsah složky J ve stacionární fázi - mol.g^-1 – obsah složky J v mobilní fázi - mol.cm^-3 • MECHANISMUS ADSORPCE – POVRCH ADSORBENTU OBSAZEN ELUENTEM – SILNĚJI SE ADSORBUJÍCÍ SLOŽKA VYTĚSŇUJE ELUENT Kapalinová chromatografie • MECHANISMUS ADSORPCE – adsorpční rovnováha - popis - ADSORPČNÍ ISOTERMY – LANGMUIROVA ISOTERMA - tvorba monovrstvy » lineární v oboru nízkých koncentrací – tvar isotermy ovlivňuje tvar chromatografického píku » Gaussův profil pro lineární isotermu » „protažené píky“ („chvostování“) - nelineární část isotermy (příliš vysoké koncentrace) Kapalinová chromatografie • STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC • ADSORBENT - kulovité částice - AE ~ 10 μm • obvykle silně polární • plně porézní – silikagel - hydratované SiO[2] - KYSELOST POVRCHU » NUTNÁ AKTIVACE - „přiměřené“ vysušení [» ] SILNÁ RETENCE BAZICKÝCH LÁTEK » silikagel s velkými póry » s malými póry - pod 10 nm – alumina - OXID HLINITÝ - hydroxylové skupiny na povrchu - silné elektrostatické pole u povrchu – Florisil - křemičitan hořečnatý Kapalinová chromatografie • STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC • ADSORBENT - kulovité částice - AE ~ 10 μm – alumina - OXID HLINITÝ » BAZICITA POVRCHU - DĚLENÍ SLABĚ KYSELÝCH SLOŽEK - silné kyseliny - CHEMISORPCE » silné elektrostatické pole u povrchu » při přiblížení adsorbátu - v molekule indukovaný dipól-moment » vliv geometrie adsorbátu - (ne)planarita » AKTIVACE -podobná jako u silikagelu – Florisil - křemičitan hořečnatý Kapalinová chromatografie • STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC • ADSORBENT - kulovité částice - AE ~ 10 μm – Florisil - křemičitan hořečnatý » polární adsorbent » vlastnosti - mezi silikagelem a aluminou » 84% SiO[2], 15,5% MgO, 0,5% Na[2]SO[4 ]» ENVIRONMENTÁLNÍ ANALÝZY » SEPARACE POLÁRNÍCH LÁTEK z nepolárních matric » separace chlorovaných pesticidů a PCB » analýza organofosfátů » separace steroidů » separace dusíkatých látek od uhlovodíků Kapalinová chromatografie • MOBILNÍ FÁZE pro LSC – odplyněná, zbavená prachových částic – nepolární mobilní fáze (polární jsou adsorbenty) – stupnice dle eluční síly (empirický parametr) • větší eluční síla - eluent pevněji sorbován • pentan - cyklohexan - benzen - diethylether - dichlormethan - aceton - isopropanol - voda • BĚŽNĚ POUŽÍVÁNY BINÁRNÍ ELUENTY – např. HEXAN + diethylether – GRADIENTOVÁ ELUČNÍ CHROMATOGRAFIE » PLYNULÉ ČI „SKOKOVÉ“ ZMĚNY SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE Kapalinová chromatografie • SEPAROVANÉ SLOŽKY v LSC – polární sorbent U více zadržovány polární látky, látky s větší molekulovou hmotností – málo zadržovány - nepolární uhlovodíky – na kyselém sorbentu - více zadržovány bazické látky – na bazickém sorbentu - více zadržovány kyseliny • Kapalinová chromatografie - LC • Kapalinová chromatografie - LC • Kapalinová chromatografie - LC • Kapalinová chromatografie - LC • Kapalinová chromatografie - LC • Kapalinová chromatografie - LC • Kapalinová chromatografie - LC • Kapalinová chromatografie - LC • GELOVÁ PERMEAČNÍ chromatografie - GPC • GELOVÁ PERMEAČNÍ chromatografie - GPC • IONTOVÁ chromatografie - IEC • IONTOVÁ chromatografie - IEC • IONTOVÁ chromatografie - IEC • chromatografie S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC • chromatografie S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC • chromatografie S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC • chromatografie S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU - SFC • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY • ELEKTROMIGRAČNÍ METODY