ROZPTYLOVÉ a EMISNÍ metody ROZPTYLOVÉ a EMISNÍ metody Ramanova spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Principy Ramanovy spektroskopie Principy FT Ramanovy spektroskopie Instrumentace Speciální techniky • rezonanční - RR • povrchem zesílený - SERS • rezonanční povrchem zesílený - SERRS • fotoakustický - PARS • hyperRaman • koherentní anti-Stokes - CARS • koherentní Stokes - CSRS Studované materiály VZORKY • anorganické - korozní vrstvy - povrchy pevných disků, křemík - amorfní uhlík, diamanty • organické - supramolekulární systémy - systémy na nosičích • polymery - fotolabilní materiály • biologické - in vitro, in vivo • geologické - minerály, horniny • archeologické - od paleolitu po novověk Studované materiály GEMMORAMAN - 1980 drahokamy FRESCORAMAN - 1980 anorg. barviva ICONORAMAN - 1985 org. barviva PETRORAMAN - 1995 kameny RESINORAMAN - 1995 amorf. org. m. TISSUERAMAN - 1997 tkáně CERAMORAMAN - 1998 keramika METALLORAMAN - 1999 koroze kovů VITRORAMAN - 1999 skelný stav CLIMATORAMAN - 1999 vlivy klimatu na m. Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod Ramanova spektrometrie - ANALÝZA MATERIÁLŮ - polovodiče - kontrola povrchu pevných disků, Seagate 1992 - magnetických hlav - uhlíkové materiály Analýza uhlíkatých materiálů Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod Ramanova spektrometrie - ANALÝZA ropných produktů - stanovení oktanového čísla analýza automobilových olejů Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod FT Ramanova spektrometrie - ANALÝZA ropných produktů - stanovení oktanového čísla - analýza automobilových olejů - stanovení obsahu alkoholu - kontrola biotechnologií - analýza ve farmaceutickém průmyslu Identifikace drog Identifikace léčiv Fluorescence Fluorescence a fosforescence Fluorescence a fosforescence • FLUORESCENCE • luminiscence s krátkým dosvitem – spinově dovolený přechod - bez změny orientace elektronového spinu • FOSFORESCENCE • luminiscence s dlouhým dosvitem – spinově zakázaný přechod - změna orientace elektronového spinu • možný díky spin-orbitální interakci Fluorescence a fosforescence • DOBA ŽIVOTA EXCITOVANÉHO STAVU – kinetika „zániku“ excitovaného stavu • INTENZITA fluorescence a fosforescence – KVANTOVÝ VÝTĚŽEK • počet vyzářených fotonů vůči počtu absorbovaných - VLIV NEZÁŘIVÝCH PROCESŮ - intra- a inter- molekulárních Fluorescence a fosforescence • STRUKTURA MOLEKULY – dvojné vazby - aromáty, konjugované C=C – heteroatomy - C=O, dusíkaté heterocykly – VLIV SUBSTITUENTŮ - -OH, -NO, -NO[2] … – RIGIDITA struktury π-elektronového systému – CHELÁTY • MEZIMOLEKULOVÉ INTERAKCE – především zhášení luminiscence – vliv pH, teploty, viskozity, polarita rozpouštědla Fluorescence a fosforescence • MĚŘENÍ STACIONÁRNÍCH SPEKTER – spektrofluorimetr MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence Fluorescence a fosforescence • MĚŘENÍ STACIONÁRNÍCH SPEKTER – spektrofluorimetr • zdroj záření - xenonová výbojka - nízkotlaká rtuťová výbojka • křemenné kyvety • mřížkové monochromátory • detektor - fotonásobič – excitační a emisní spektra • excitační - změna vlnové délky excitujícího záření konstantní λ emisního toku • emisní - fixovaná λ excitujícího záření proměnná λ emisního toku Fluorescence a fosforescence • STACIONÁRNÍ SPEKTRA – knihovny spekter • charakteristická spektra polyaromatických uhlovodíků • charakteristická spektra fluorescenčních indikátorů • ČASOVĚ ROZLIŠENÁ SPEKTRA – měření doby života excitovaných stavů • snazší u fosforescence • obtížnější u fluorescence - studium přenosu energie Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra - pásové spektrum - malý počet širokých pásů - kvantový výtěžek fluorescence - samoabsorpce - zhášení rozpouštědlem či „zhášedly“ STANOVENÍ NÍZKÝCH OBSAHŮ PŘEDEVŠÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra PŘÍMÉ METODY - stanovení PAH - stanovení hemoproteinů - stanovení vitamínů - stanovení steroidů Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra NEPŘÍMÉ METODY - tvorba chelátů - např. s morinem - stanovení hliníku - stanovení aniontů na principu zhášení fluorescence - stanovení na základě reakce provázené vznikem fluoreskujícího produktu Kvantitativní spektrometrie Klíčový požadavek - vyjádřit VZTAH MEZI KONCENTRACÍ (OBSAHEM) ANALYTU a SPEKTRÁLNÍ VELIČINOU - matematické vyjádření - experimentální kalibrace a validace (externí standardy, metoda standardního přídavku) SPEKTRÁLNÍ VELIČINA – absorpční metody – emisní metody – rozptylové metody – reflexní metody Metody kalibrace Důležité pojmy • Metoda kalibrační křivky (external standards) – připravíme sérii kalibračních roztoků stanovovaného analytu, pokrývající zamýšlený koncentrační rozsah – snažíme se, aby bylo stejné složení matrice jako u vzorku – předpokládáme, že vliv matrice je zanedbatelný – (když je rozsah koncentrací analytu omezen, vystačíme třeba i s dvěma standardy - „pod“ a „nad“ vzorky) Metody kalibrace Důležité pojmy • Metoda standardních přídavků (internal standards) – použitelná v případě, že je nemožné potlačit interference matrice – ke změřenému vzorku je přidáno malé množství roztoku standardu a stanovení se opakuje za maximálně možných stejných podmínek – metoda je mnohem náročnější na množství práce, vhodná pro ověření vlivu matrice Metody kalibrace Důležité pojmy • Metoda vnitřního standardu – do všech analyzovaných vzorků i kalibračních (validačních) roztoků je přidáno stejné množství vhodné čisté látky odlišné od analytu – jako kalibrační křivku vynášíme poměr odezvy analyt/standard proti koncentraci analytu ve standardních roztocích – vnitřní standard by měla být látka podobná analytu, jejíž signál však neinterferuje se signálem analytu Kvantitativní spektrometrie ATOMOVÁ EMISNÍ spek. – emisní metoda ATOMOVÁ ABSORPČNÍ spek. – absorpční metoda MOLEKULOVÁ spek. UV, vis – absorpční metoda, (reflexní metoda) – luminiscence – emisní metoda NIR – absorpce, reflexe MIR, FIR – absorpce, reflexe Raman – rozptyl NMR spektrometrie, hmotnostní spektrometrie Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA – pro absorpční metody - absorpce fotonů – závisí na množství excitovatelného analytu DŮLEŽITÉ FAKTORY - vstupní tok záření - tloušťka absorbující vrstvy - absorpční koeficient - napierovský, dekadický - molární absorpční koeficient - - napierovský, dekadický Kvantitativní spektrometrie - vztah k tloušťce vrstvy Kvantitativní spektrometrie - vztah ke koncentraci Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA – pro absorpční metody - ABSORBANCE DŮLEŽITÉ FAKTORY - vlnová délka vstupního záření - eliminace jiných optických jevů - rozptyl, odraz, lom, fluorescence … - eliminace saturačního efektu - směs analytů Kvantitativní spektrometrie ABSORPČNÍ METODY - efekty ovlivňující hodnotu molárního absorpčního koeficientu DŮLEŽITÉ FAKTORY - závislost na vlnové délce vstupního záření - chemické reakce analytu - mezimolekulové interakce s rozpouštědlem - mezimolekulové interakce s jinými analyty - vliv teploty na stabilitu analytu Kvantitativní spektrometrie ABSORPČNÍ METODY - ABSORBANCE - neměříme před a za vzorkem, ale SE VZORKEM a BEZ VZORKU - jednopaprskové a dvoupaprskové uspořádání - pásové spektrum - výška píku - plocha píku - KOREKCE POZADÍ - vlivy matrice, další vlivy Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA – emisní metody - emise fotonů – závisí na množství excitovaného analytu EMITOVANÝ ZÁŘIVÝ TOK úměrný KONCENTRACI analytu - celkové množství analytu ve vzorku - způsob excitace - možnosti nezářivé deexcitace - rušivé emisní procesy - rušivé absorpční procesy (samoabsorpce) - závislost na vlnových délkách Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA – reflexní metody - počet odražených fotonů úměrný koncentraci – závisí na množství ozářeného analytu - celkové množství analytu ve vzorku - reflektivita vzorku a dalších materiálů - absorpce záření během odrazu - lom dopadajícího záření / totální odraz Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA – rozptylové metody - počet rozptýlených fotonů úměrný koncentraci (Ramanův rozptyl, nefelometrie) - zeslabení transmitovaného toku záření (turbidimetrie) – závisí na množství excitovaného (ozářeného) analytu - celkové množství analytu ve vzorku - způsob excitace - rušivé emisní procesy - LUMINISCENCE Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ DATA vs. KONCENTRACE - kalibrace, validace, měření neznámých vzorků - zpracování dat - regresní metody - postupy kalibrace - sada nezávislých roztoků - metody standardního přídavku - zpracování kalibračních dat - jeden analyt - více sledovaných analytů Kvantitativní spektrometrie Zpracování kalibračních dat - jeden analyt - více sledovaných analytů - univariátní a multivariační metody - zpracování úseků spekter či celých spekter - analýza složitých směsí Kvantitativní spektrometrie • CLS - classical least squares • ILS - inverse least squares • MLR - multiple linear regression • (PCA - principal component analysis) • PCR - principal component regression • PLS1 - partial least squares 1 • PLS2 - partial least squares 2 Regrese CLS • klasická metoda nejmenších čtverců - „K-matrix“ • předpoklad platnosti Lambertova - Beerova zákona při všech vlnových délkách (frekvencích) - absorbance je funkcí koncentrace • chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení absorbancí • použitelná i pro celá spektra • všechny komponenty musí být známy a zahrnuty do kalibrace Regrese ILS • inverzní metoda nejmenších čtverců - „P-matrix“ • předpoklad platnosti inverzního Lambertova - Beerova zákona pro všechny koncentrace - koncentrace je funkcí absorbance • chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení koncentrací • použitelná pro omezený počet vlnových délek • komponenty nezávislé, postačuje znalost jedné složky v kalibračních směsích Regrese PLS • ortogonální transformace dat do systému souřadnic označovaného jako hlavní komponenty - PC - redukce počtu potřebných souřadnic