LC-ICP-MS pro speciační analýzu Viktor Kanický Katedra analytické chemie PřF MU v Brně Laboratoř atomové spektrochemie 3.škola HPLC/LC-MS Doubí 29.8. – 2.9. 2005 u Atomová spektroskopie a speciace u Tandemové techniky u Kapalinová chromatografie u Indukčně vázané plazma ICP jako zdroj iontů u MS u Interference u Oblasti speciační analýzy Celkový obsah prvku x jeho výskyt v různých chemických formách u Atomová spektroskopie – stanovení celkových obsahů kovů a metaloidů u Výskyt kovů v reálném světě: – Zřídka - ryzí nebo jednoduché ionty – Převážně - součást sloučenin (specií) vznikajících v řadě bio(geo)chemických procesů u Důsledky existence specií: – Chyby stanovení: nekvantitativní separace, vliv chemické formy na atomizaci v plameni – Odlišné chování v přírodě (mobilita, akumulace) a účinky na organismy (toxicita, esencialita) Kovy, specie, biologické účinky u Toxické i prospěšné účinky kovů závisejí na biologických, fyzikálních a chemických vlastnostech jejich sloučenin - specií. u Specie je nositelem informace o biodostupnosti TH toxicita a esencialita u Informace o celkovém obsahu daného stopového prvku v životním prostředí, v organismu, má omezenou výpovědní hodnotu, případně je zavádějící. u Požadavky na nové analytické metody, umožňující stanovení daného prvku a současně jeho distribuci v různých formách a stanovení těchto forem Speciační analýza u Analytická chemie od 80. let 20. století – nový směr „speciace stopových prvků a metaloidů“ u Termín „speciace“zavedli spektroskopisté: hledání „nových“ analytů jako východisko z neuspokojivě malého počtu prvků periodického systému ☻ u Speciační analýza – průnik anorganické a organické analytické chemie u Speciace, speciační analýza - stanovení koncentrací jednotlivých fyzikálně-chemických forem prvku, jejichž součet tvoří celkovou koncentraci prvku ve vzorku Rozsah speciační analýzy u Rozlišované formy prvku: – Různá chemická individua (oxidační stavy, organokovové sloučeniny, komplexy) – Jednotlivé podíly: u vázané na různé fáze systému (v půdách), u na skupiny sloučenin (bílkoviny, polysacharidy) u na biologické struktury (organely, biomembrány, buňky) u Speciační analýza dále zahrnuje postupy pro izolaci, detekci, kvantifikaci, charakterizaci a identifikaci vazebných ligandů Zájmové specie ve speciační analýze Zájmové specie ve speciační analýze Požadavky na speciační techniku • Jistota, že je stanovována určitá specie a ne jiná (selektivita) • Dostatečně nízká mez detekce X • Speciačně selektivní techniky (Moessbauerova spektroskopie, XPS, ESR, MS a MS/MS mají v přítomnosti matrice reálných vzorků nedostatečné meze detekce • Nespecifické detektory separačních technik (UV, FID) mají malou citlivost a velký šum Kombinované analytické techniky u Speciační analýza – soubor tandemových technik založených na on-line spojení separační techniky s vysokým rozlišením s prvkově specifickou detekcí u Atomová spektrometrie– dokonalá atomizace, excitace a ionizace prvků nezávislá na jejich původní speciích TH kvantitativní, robustní, spolehlivé stanovení prvku (bez „matrix efektů“) u Separační metody – rozdělení specií chromatografickými a elektromigračními technikami Tandemové techniky Izolace analytu ze vzorku Izolace analytu ze vzorku u Vody – extrakce organickými rozpouštědly – extrakce pevnými sorbenty – převedení na těkavé látky, jejich zachycení a uvolňování u Půdy a sedimenty – sekvenční extrakce s různými činidly – Soxhletova extrakce – kapalinová extrakce pomocí u ultrazvuku u mikrovlnného pole – superkritická fluidní extrakce Izolace analytu ze vzorku u Biologické materiály – sekvenční extrakce u vodou u roztoky elektrolytů (izolace bílkovin) u organickými rozpouštědly (lipidy a organokovové sloučeniny) – solubilizace u enzymatická hydrolýza (směs lipáz a proteáz) u loužení s kyselinou octovou u alkalická hydrolýza s TMAH u loužení směsí NaOH-MeOH nebo HCl-MeOH Kapalinová chromatografie s ICP-MS u rozdílné průtoky mobilní fáze jednotlivými systémy u citlivost plazmatu na organická rozpouštědla u nové zmlžovací / transportní systémy: – mikrokoncentrické s mlžnou komorou: – Micro Mist, MCN, HEN – ultrazvukový zmlžovač (USN) – vysokotlaký (HPN) s desolvatační komorou – s přímým dávkováním (DIN, DIHEN) – termosprej – elektrosprej Kapalinová chromatografie s ICP-MS u Mikrokolony a kapilární kolony s redukovanými průtoky 1-100 μL/min; zvýšení koncentrace eluovaného analytu u Snižování velikosti částic stacionární fáze TH zkrácení kolony a zvýšení rozlišení při konvenčních průtocích vzorků pro ICP-MS (1 – 1.5 mL/min) u Post-kolonová derivatizace – chemická volatilizace (mikrovlnná, UV, „thermally assisted“) – generování těkavých hydridů vybraných prvků ICP-QMS Historie q 1964 – S. Greenfield, Ar/N[2] ICP-OES q 1965 - Wendt a V. Fassel, Ar/Ar ICP-OES q 1974 – A. Gray, ARL, DCP vzorkování do MS q 1976 - SCIEX Inc., výzkum MIP q 1978 – R.S.Houk & Fassel na Iowa State University, ionty z ICP poprvé zachyceny v MS q 1979 - Gray z ARL přichází na Iowa State Univ. q 1980 - Gray se vrací do U.K., Univ. of Surrey a společně s A. Date (Brit. Geol. Survey): první konstrukce ICP-MS q 1981- Douglas & French vyvinuli první prakticky použitelný interface pro přestup iontů z ICP za atmosférického tlaku do MS (vakuum) Historie q 1983 - SCIEX na Pittsburgh Conference: první komerční ICP-MS: ELAN 250 (kvadrupól) q 1989 - VG Elemental uvádí VG PlasmaTrace™, první ICP-MS s vysokým rozlišením q 1994: VG Elemental uvádí VG Plasma 54, první ICP- MS s hmotnostním analyzátorem s magnetickým sektorem pro měření izotopových poměrů. q Ročně se prodá celosvětově 450 – 500 ICP-MS Výrobci ICP-MS u Kvadrupólový filtr – Agilent (HP) – Micromass – Perkin-Elmer-Sciex – Spectro Analytical – TJA Solutions (VG) – Varian – Japonsko (Seiko, Shimadzu, Hitachi) u Sektorové analyzátory – Finnigan – JEOL – Micromass – Nu Instruments – TJA Solutions u Průletové analyzátory – GBC – Leco Specifikace ICP-MS • Spojení (interface) zdroje ICP a hmotnostního spektrometru musí vykonávat následující funkce a splňovat tyto požadavky: • Vzorkovat ionty v místě jejich vzniku, tj. v ICP. • Převést ionty z oblasti atmosférického tlaku do vakua. • Snížit teplotu z 6000 K na laboratorní teplotu. • Zachovat stechiometrii analytů při transportu iontů. Princip indukčně vázaného plazmatu ICP • vysokofrekvenční generator 27 - 64 MHz • iniciace výboje jiskrou: ionizace – elektrony urychlovány elektromagnetickým polem • lavinovitá ionizace Ar + e^- ® Ar^+ + 2 e^- • indukční cívka, 3-5 závitů - primární vinutí transformátoru • elektrony v plazmatu – sekundární vinutí • ICP – vnější plazmový plyn 12-15 L/min Ar • centrálně zaváděný nosný plyn s aerosolem 0.6 - 1 L/min Zóny centrálního (analytického) kanálu ICP Ionizace v ICP výboji § Ionizace v Ar ICP je v určována E[i1](Ar)=15.76 eV § Kromě F, Ne a He mají všechny prvky E[i1]< 16 eV TH ICP produkuje ionty X^+ pro všechny zájmové prvky § 87 prvků ze 103 má E[i1]< 10 eV a tedy α > 50% § 69 prvků ze 103 má E[i1]< 8 eV a tedy α > 95 (90)% § S výjimkou Ca, V, Sr, Y, Zr, Sn, Ba, Pb a lanthanoidů jsou ionizační energie do 2. stupně E[i2] > 16 eV; tvorba X^2+ je významná pouze v případě Sr, Ba (Pb) Závislost stupně ionizace na ionizační energii Závislost stupně ionizace na ionizační energii Výhody ICP jako ionizačního zdroje • ICP je účinným atomizačním zdrojem • ICP ionizuje téměř všechny prvky pouze do 1. stupně a polovina prvků periodické soustavy je ionizována téměř na 100% • Ionty zůstávají vymezeny v centrálním kanálu výboje, což usnadňuje jejich vzorkování do MS • Lineární dynamický rozsah 9 řádů • Meze detekce: ppq, ppt ICP-MS vs ICP-OES u ICP-OES má některé nedostatky: üNěkteré prvky ( např. Cd, Pb, U, As, Se) nemají dostatečně nízké meze detekce pro stanovení jejich (i celkových) obsahů. üMeze detekce většiny prvků jsou příliš vysoké pro použití ICP-OES jako prvkově specifického detektoru pro separační techniky (HPLC, GC, CZE) včetně speciace chemických forem üTechnika ICP-OES je zatížena četnými spektrálními interferencemi, zejména v případě osnovy, jako je U, W, Fe, Co,... ICP-MS vs ICP-OES u ICP-OES: – koncentrace solí v roztocích až do 10%, běžně 1% – Světlo je „čisté“, spektrometr se nekontaminuje u ICP-MS: – Koncentrace solí max. 0,5 %, koroze konusů – Kontaminace spektrometru, detektor … Meze detekce v ICP-OES/MS Zavádění vzorku do plazmatu Zavádění vzorku do plazmatu Zavádění vzorku do plazmatu Dvoustupňový interface u Zajišťuje přestup iontů vznikajících za atmosférického tlaku při vysoké teplotě do vakua při laboratorní teplotě. u Interface zahrnuje prostor mezi ICP a MS vymezený dvěma kovovými kuželovými clonami, v němž je udržován mechanickou vakuovou pumpou tlak 1 až 2,5 torr, tj. 10^2 Pa (1. stupeň) a dále prostor za vnitřní kuželovou clonou před iontovou optikou (2. stupeň), kde klesá tlak na 10^-4 torr (10^-2 Pa) čerpáním olejovou difusní nebo turbomolekulární pumpou. u Vnější kužel (sampling cone, sampler, extraction cone) je vnořen do ICP a odebírá z kanálu v oblasti NAZ ionty. Průměr otvoru je cca 1 mm. Vzdálenost mezi otvorem a indukční cívkou se nazývá hloubka vzorkování (sampling depth) a je obdobou výšky pozorování u ICP-OES. Zde vstupuje iontový paprsek, který dále expanduje nadzvukovou rychlostí. Materiál sampleru je Ni,Cu, Pt; chlazení vodou, životnost 2-6 měsíců. Dvoustupňový interface u Vnitřní kužel (skimmer) je umístěn 2-10 mm za vnějším kuželem. Průměr otvoru je 0.4-0.9 mm. Mezi clonami je udržován tlak 133 Pa (1 torr). Tento kužel vzorkuje nadzvukový proud plynu vznikající při expanzi za sampling cone. Skimmer propustí do spektrometru cca 1% vzorku. Může být zhotoven podobně jako sampler z Ni, Al, Cu, Pt nebo z nerez. oceli a má životnost nejméně rok. u Skimmer je oddělen od vlastního spektrometru clonou většího průměru, která odděluje prostor za skimmerem (10^-4 torr, 10^-2 Pa) od prostoru s iontovou optikou (10^-5 až 10^–6 torr, 10^-3 až 10^-4 Pa). Za turbomolekulární pumpu je zařazována obvykle ještě rotační olejová pumpa. Poloha skimmeru u Při expanzi plynu/plazmatu do vakua (10^2 Pa), se paprsek šíří nadzvukovou rychlostí (Mach 10) a plazma se ochlazuje. u Vznik Machova disku ve vzdálenosti X[M]: X[M] = 0.67 D[0] (P[0]/P[1])^1/2 u Poloha skimmeru vzhledem k Machovu disku: X[E] = 2/3 X[M] což je 6 - 10 mm. Problém parazitního obloukového výboje u ICP vykazuje vůči zemi napětí 100-300 V (kapacitní pole), které může způsobit vznik obloukového výboje mezi ICP a samplerem s následkem eroze sampleru a produkce fotonů. u Uzemnění cívky: – na sampler – cívka se středním vývodem Iontová optika u Paprsek vystupující ze skimmeru je divergentní (space charge effect). Před vstupem paprsku do vlastního spektrometru je třeba vytvořit kolineární paprsek, jehož ionty mají energii v úzkém pásmu. u Je třeba odstranit fotony, aby nevyvolávaly parazitní signál na detektoru.Toto řeší iontová optika. Příklad interface: VG PQ3 Analyzátory pro ICP-MS u Statické analyzátory: analyzátory sektorové = současně disperse a zaostření (hranol + čočka). – Ionty zvoleného poměru m/z jsou přivedeny na centrální dráhu kombinací statických polí – použití zejména pro u spektrometrii vysokého rozlišení (s dvojí fokusací) u měření izotopových poměrů u Dynamické analyzátory: – stabilní dráhy iontu m/z mezi zdrojem a detektorem je dosaženo s využitím radiofrekvenčního pole (kvadrupólový filtr) – rozdělení iontů podle m/z se určí z doby letu mezi zdrojem a detektorem (analyzátor z doby letu) MS používané s ICP zdrojem Tytéž systémy jako pro org. analýzu, jen rozsah hmotností je < 300 amu. u Kvadrupólový filtr (QMS) u Sektorový analyzátor (SFMS), single a multicollector u Průletový analyzátor (TOF-MS) u Iontová past (IT-MS) Rozlišovací schopnost (resolving power) Praktická rozlišovací schopnost Uspořádání Nier-Johnson HR Axiom ICP-MS: E + B Finnigan Element: B + E E+B uspořádání Mattauch-Herzog Laserová ablace s ICP spektrometrií Laserová ablace – Laser Ablation Spojení laserové ablace (LA) s technikami OES a MS l Optická emisní spektrometrie v laserem indukovaném plazmatu LM-OES, LIPS, LIBS l LA –ICP- OES, optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem a laserovou ablací l LA-ICP-MS, hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem a laserovou ablací Instrumentace LA-ICP spektrometrie Priority spektroskopie s laserovou ablací l Analýza povrchů a povlaků: lokální analýza, mikroanalýza, plošné mapování (analýza mineralogických výbrusů, gelová elektroforéza) l Stanovení průměrného složení (bulk analysis) PMateriály elektricky vodivé i nevodivé PKompaktní materiály (ocel, slitiny, sklo, keramika) PPráškové materiály (lisované tablety nebo vytavená skla, např. s Li-boraxem l Pořizování hloubkových koncentračních profilů, analýza inkluzí v minerálech Spektrální interference v ICP-MS Izobarické překryvy II u Prvky tvořící stabilní oxidy : Ca, Ti, Cr, Sr, Zr, Mo, Nb, Ba, Ce, La, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Dy, Tb, Er, Ho, Yb, Tm, Hf, Lu, Ta, W, Th, U. u Prvky tvořící 2x nabité ionty : Ca, Sc, Ti, Sr, Y, Zr, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Th, U. Překryvy iontů oxidů Překryvy iontů oxidů, hydroxidů a iontů X^2+ Další polyatomické interference u Ar: monomer a dimer, kombinace mezi izotopy 36, 38 a 40. u voda: O, OH, kombinace s Ar u vzduch: N[2], N[2]H, N u kyseliny, Cl, S, kombinace s Ar, O, H u Další specie. Isobarické interference - Ar Spektrální překryvy - Se Potlačení spektrálních interferencí u Použitím lepšího rozlišení u Použitím « cold » podmínek v ICP pro snížení tvorby iontů s argonem. u Použitím reakční/kolizní cely pro disociaci/odstranění rušících iontů ^40Ar^16O^+ vs ^56Fe^+ u Cold plasma: Snížení tvorby Ar^+ a tedy i ArO^+ u High resolution: Separace píků ArO^+ and Fe^+ u Reakce v plynné fázi/kolize v cele: ArO^+ + NH[3] ® ArO + NH[3]^+ Rozlišení polyatomických interferencí Podmínky „studeného (cold, cool)“ ICP uNízký příkon, vysoký průtok nosného plynu. uVhodné pro roztoky s malým obsahem rozpuštěných látek. uEliminuje interference Ar^+, ArO^+, ArH^+, ArCl^+, ArC^+, C[2]^+. uZvyšuje úroveň MO^+ z <1% až na >20%. uVýznamné matrix efekty (nerobustní podmínky v ICP). Separace signálů analytu a interferentu Reakční/kolizní cely u Reakce v rf-kvadrupólové cele (DRC, dynamic reaction cell, PE 6100), u Kolize v rf-hexapólové cele (Micromass Platform, TJA ExCell). ELAN 6100DRC Selektivita reakcí ^40Ar^16O^+ a ^56Fe^+ u ArO^+ + NH[3] ® ArO + NH[3]^+ s rychlostní konstantou 1.4 ´ 10^-9 cm^-3 s^-1. u Fe^+ + NH[3] ® Fe + NH[3]^+ s rychlostní konstantou 0.91 ´ 10^-11 cm^-3 s^-1. „Molekulární“ informace o prvku a účinek • Chemické, biologické a toxikologické vlastnosti prvku závisejí na formě, v níž se prvek vyskytuje TH dopad do mnoha oblastí PHodnocení rizik v životním prostředí PEkotoxikologie PPotravinářský průmysl PHygiena a zdraví v pracovním prostředí PKlinická chemie a medicína PPrůmyslová analýza •Hodnocení rizik v životním prostředí • Monitorování složek životního prostředí (vzduch, voda, půdy, sedimenty, biota) z hlediska antropogenního znečištění toxickými speciemi: üOrganoolovem z dříve používaného benzínu üOrganocínem z nátěrů lodních trupů üToxickými redoxními stavy iontů: Cr(VI), Sb(III) ü produkty biomethylace kovů (Hg, As, Se) • Studium biogeochemických procesů, mechanismů transportu a interakcí organických látek s ionty kovů pro účely řízení skládek odpadů a remediace půd •Ekotoxikologie • Sledování esenciálních (Zn, Cu) a toxických (Cd, Hg, As) prvků a jejich specií, zejména metalothioneinů (proteiny 6-7 kDa s vysokým obsahem cysteinu schopné vázat kovy, odolné vůči tepelné koagulaci a srážení kyselinami) • Methylace rtuti • Tvorba arsenobetainu a arsenocukrů v mořské fauně •Potravinářský průmysl • Kontaminace potravin Hg, Sn, Pb: ü Ústřice a škeble: organocíničitými sloučeninami ü Ryby: organicky vázanou rtutí ü Vína: alkylolovem z provozu motorových vozidel ü Legislativní opatření na základě speciace: ryby, měkkýši a víno jsou významné komodity. • Arsen – v potravinách obsažen převážně ve formě netoxického arsenobetainu • Arsen v aditivech v krmivech pro zvířata • Organicky vázaný cín se uvolňuje z obalového materiálu PVC • Biologická dostupnost Cu, Fe, Se z výživových zdrojů závisí na jejich speciaci •Hygiena a zdraví v pracovním prostředí • Toxicita prvku závisí na jeho chemické formě • Identifikace těkavých forem a vdechnutelných částic • Příklad sledovaného parametru v průmyslové hygieně: Cr(VI) v prachových částicích při svařování oceli • Studium kinetiky vylučování stopových prvků, jimž je organismus vystaven v pracovním prostředí, se děje prostřednictvím biomarkerů dané expozice (např. speciace As v moči) •Klinická chemie a medicína • Metaloproteiny: regulace, ukládání, katalýza, transport: üFerritin (Fe, Cu, Zn), ß-amyláza (Cu), anhydráza kyseliny uhličité (Cu, Zn), alkoholdehydrogenáza (Cd, Zn) üOxidační stavy těchto prvků • Esenciální prvky v mateřském mléce, v syntetické výživě • Terapeutické preparáty: üDiagnostické zobrazování: Tc - merkaptoacetylglycin (ledviny, srdce, mozek, různé formy rakoviny) üCytostatika: na bázi Pt, Au: cis-platina, auranofin üAntiarthritika: Au: aurothioglukóza • Doplňky stravy: kontrola Co, Cr, Fe, Se, Zn • Dialýza: Al, Cr nečistoty, vázané na malé molekuly •Průmyslová analýza • Geometaloporfyriny obsahující Fe, V, Co a Ni, jejichž chování je při destilaci a rafinaci ropy podstatně odlišné od chování jednoduchých anorganických iontů těchto prvků, což zvyšuje riziko otravy katalyzátorů • Analytická kontrola uvolňování organických sloučenin cínu, které se používají jako: P katalyzátory při výrobě farmak P stabilizátory při výrobě polymerů. L. Bendahl and B. Gammelgaard J . A n a l . A t . S p e c t r o m ., 2 0 0 5 , 2 0 , 410–416 SEC-ICP-MS Study of mercury–selenium interaction in chicken liver by size exclusion chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry Ana I. Cabanero, Yolanda Madrid and Carmen Camara* J . A n a l . A t . S p e c t r o m . , 2 0 0 5 , 2 0 , 847–855 SEC-ICP-MS In order to estimate metal distribution patterns in biomolecules of different sizes and their possible livers were evaluated. For this purpose 72 chickens were fed under different controlled conditions. Chickens were exposed to Hg(II) and MeHg added to feed with or without selenium supplementation. Size-exclusion chromatography with ICP-MS detection was developed for multielemental (S, P, Cu, Zn, Se, Mn, Fe and Hg) speciation in chicken liver cytosol and optimisation of the separation parameters (25 mM Tris-HCl buffer, 50 mM KCl, pH 6.8, 1 ml min1) was carried out. The liver extracts were injected into the column four times each and the variation between the runs was small (RSD o10%). The recovery of the chromatographic step varied between 82–102%, indicating some interaction between the liver extracts and the column material. S, Cu, Zn, Fe, Se and Hg appeared mainly associated to high and medium-molecular weight species (4300–45 kDa), whereas Mn is mainly associated to high (116 kDa) and low (0.03 kDa) molecular weight species and P is mainly associated to low molecular weight species (5.5 kDa). Changes in the subcellular distribution and distribution patters caused by long-term Hg–Se administration have beendiscussed. SEC-ICP-MS Děkuji Vám za pozornost Speciace a frakcionace u Speciace všech forem prvku vyžaduje poměrně náročné vybavení separačními technikami. u Frakcionace : rozdělení vzorku do několika frakcí – skupin, ve kterých se vyskytují formy s podobnými chemickými či fyzikálními vlastnostmi TH jednodušší instrumentace u V každé z frakcí se stanoví celkový obsah prvku některou z metod, například atomové spektrometrie (AAS, ICP-OES, ICP-MS). Speciace a frakcionace u Pro vývoj frakcionačního schématu je však třeba mít informace o formách prvku, které se ve vzorku nacházejí, aby bylo možno podle vlastností těchto forem zvolit vhodné kroky frakcionace. u Frakcionace – mezistupeň mezi stanovením celkového obsahu prvku ve vzorku a speciační analýzou – vodítko při volbě vhodného přístupu k přípravě vzorku pro speciaci.