1
MECHANISMY PŮSOBENI MASTNÝCH KYSELIN VE STŘEVĚ A JEJICH VZTAH K ZÁNĚTLIVÝM A NEOPLASTICKÝM
ONEMOCNĚNÍM
ciborciloř Vfcokifietikv
HlaFysílc ňlní ÚKfenw flUf fl.
r
NÁDORY KOLOREKTA (CRC)
Výskyt
industrializované země (životní styl, výživa)
ČR (třetí nejčastější příčina úmrtí na rakovinu)
věková distribuce (muži nárůst případů od 60 let; ženy od 70
let)
Epitel kolorekta
střevní krypty (část proliferační a diferenciační)
výměna epitelu (zrání buněk, odumírání apoptózou-anoikis
(detachment-induced apoptosis)
koncentrace růstových faktorů v kryptách (v proliferační části více buněk produkujících GF) Kolorektální karcinogeneze
porušení rovnováhy mezi proliferací a diferenciací v kryptě hyperproliferativní krypta, adenom, adenokarcinom, karcinom, metastáz
Germany Austria Portugal Denmark Italy France Belgium European Union The Netherlands United Kingdom Sweden Luxembourg Ireland Spain Finland Greece
Incidence Mortality
Incidence per 100f000 people
Figure 1 | Colorectal cancer incidence in males in the European Union. Rates of colorectal cancer by incidence, per 100,000 people, and mortality during 1996. Data were collected from Eucan — a service that provides data on the incidence and mortality of 24 key cancers in 15 member states of the European Union2.
a Incidence rates of colorectal cancer
Struktura hlášených onemocnění novotvary bez dg. C44. A - muži; B - ženy (podle ÚZIS)
Villus
Cell
shedding
Differentiation and migration 24-48 hr
Differentiated cells
Crypt-villus junction
Goblet   Entero- Absorptive cells   endocrine epithelial cells cells
33
t t
t
Crypt
Mitotic renewal # 24 36hr 'i
Lamina propria
Proliferative progenitors
Stem cell
■ '.*•-;    Panem cell
Fig. 1. The anatomy of the small intestinal epithelium. The epithelium is shaped into crypts and villi (left). The lineage scheme (right) depicts the stem cell the transit-amplifying cells, and the two differentiated branches. The right branch constitutes the enterocyte Lineage; the left is the secretory lineage. Relative positions along the crypt-villus axis correspond to the schematic graph of the crypt in the center.
Apical surface
Direction of
migration
Basal surface
Lamina propria
Spontaneous apoptosis
□
Zone of differentiation
Zone of proliferation
Epithelial/ mesenchymal interactions
Stem ceil region
musculans externa
Lymph nodute
Sub-mucosa
Chell S et al.. BBA 2006
r
Homeostáza ve tkáních
je udržována
integrovaným systémem komunikačních mechanismů (mimo-, vnitro- a mezibuněčných)
a reguluje chování buněk především s ohledem na schopnost proliferace, diferenciace, adaptivní odpovědi a apoptózy.
Iniciované preneoplastické buňky jsou udržovány v latentním stavu v důsledku působení těchto "přirozených" regulačních mechanismů.
V podpůrné (promoční) fázi rozvoje nádorů se uplatňují
látky působící negenotoxickými (nebo epigenetickými) mechanismy, tzv nádorové promotory, které způsobují změny
chování buněk v důsledku deregulace zmíněných procesů.
Zásahy, které vedou ke změnám v expresi genů a k poruchám homeostázy se odehrávají v buňce na různých úrovních a různými mechanismy.
Střevní krypta a profil růstových faktorů
Crypt (a)
Model (b)      Growth factor profile (c)
í
o
'to o
Q_
O
0-6 0.4 0.2 0.0 Growth factor
♦ kontinuálně se obnovující buněčné populace
♦ řada zásadních fyziologických funkcí
♦ dynamická rovnováha mezi přírůstkem buněk na bázi krypty (proliferace) a úbytkem (apoptóza-anoikis) na povrchu
♦ regulace endogenními faktory (hormones and cytokines), ale rovněž složkami diety přítomnými v lumen střeva
DIFFERENTIATION
APOPTOSIS (anoikis)
Fully differentiated terminal tells
Prol iferati ng / different! atlng cells
Stem cells
APOPTOSIS
(damaged cells)
PROLIFERATION
o o
o o o
kmenové buňky
Endogenous regulators
REPLICATION STAGES
Signal transduction pathways associated with ANOIKIS
DNA-'rag mentation —ceN death
Figure 1. (a) Survival signaling pathways activated by cell-cell end cell-matrix anchorage, [r&cal Adhesion-Kinase (TAK), Integrin-linked Kinase (ILK), caveolin (cav), phosphoinositide-3-OH kinase (PI-3K), phosphatidolinositide- (3,4,5) triphosphate 3 (PIP3), Protein kinase B (PKB/AKT), ras-extrscellular signal-regulated kinase (ERK), Jun-NH2-terminal kinase (JNK)/mitogen activated protein kinase (MAPK), p70 ribosomal protein S6 kinase (S6K), lymphoid enhancer factor (LEF)/T-cell factor (TCF), Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3), adenomatosis coli gene product (APC), caspase (Casp), growth-factor receptors (GF-R), FLICE-inhibitory protein (Flip), Fas-associated death domain protein (FADD)]. (b) Signal transduction following loss o1 cell anchorage leading to anoikis. [MAP/ERK Kinase Kinase 1 (MEKK-1), Caspase (casp), cytochrome c (cytc), Fas-Ligand (Fas-L), FLICE-inhibitory protein (Flip), Fas-associatec death domain proteir (FADD), DNA fragmenting factor (DFF)].
(Continued on next page.)
Integrins
proliferation, growth, survival
Grossmann J., Apoptosis 7, 2002
INICIACE
PROMOCE
l/m
LOcj
AKTIVACE PROTO-ONKOGENŮ
IN AKTIVACE NÁDOROVĚ SUPRESOR. GENŮ
IN AKTIVACE ANTIMETASTAT. GENŮ
Mnohostupňový proces karcinogeneze
j
r
Karcinogeneze však znamená víc než jen mutagenezi
Kromě genových a chromozomálních mutací (genotoxicita) zahrnuje i NEGENOTOXICKOU SLOŽKU (EPIGENETICKÉ DĚJE)
změny v expresi genetické informace na transkripční, translační nebo postranslační úrovni
Geny jsou zapínány a vypínány
► během vývoje
► během buněčného cyklu, když buňka proliferuje
► když buňka diferencuje
► když je diferencovaná buňka stimulována k adaptivní odpovědi
Iniciovaná kmenová buňka je_omezena v dalším růstu okolními normálními buňkami.
Po expozici nádorovým promotorem nebo promočními podmínkami (buněčná smrt nebo odstranění buněk) suprimující účinek okolních buněk prostřednictvím kontaktní inhibice mizí.
r
Hlavní mechanismy charakterizující negenotoxickou karcinogenezi
■ ovlivnění mechanismů signálové transdukce
■ aktivace specifických receptoru
■ produkce reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, RNS)
■ změny GJIC
■ změny v metylaci DNA nebo v acetylaci histonů
■ ovlivnění exprese onkogenů, nádorově supresorových genů a genů buněčného cyklu
■ změny buněčného cyklu
■ změny proliferace (regenerativní nebo mitogenní)
■ změny v apoptóze
■ změny v rovnováze vyúsťující ve změnu obratu buněk ve tkáni
r
VYZIVA
hraje roli při vzniku v aterosklerózy, nádoru a řady dalších onemocnění. Mechanismy jsou předmětem výzkumu Je prokázáno, že
vysoký příjem kalorií a tvorba tukových zásob je rizikovým faktorem.
Příjem, absorpce a metabolismus velkého množství potravy vyžaduje oxidatívni
metabolismus a produkuje více reaktivních kyslíkových radikálů, které poškozují DNA.
Ukázalo se, že příjem tuků, zejména živočišných zvyšuje riziko aterosklerózy a nádorů.
Epidemiologické studie předpokládají
pozitivní korelaci mezi příjmem tuků a nádory prsu, kolonu a prostaty.
Navzdory dlouhé historii studií tuků a nádorů, zůstává řada protikladů.
Ukazuje se, že nejen kvantita, ale i kvalita tuků hraje důležitou roli, a že se zde uplatňují i rostlinné oleje a rybí olej, zejména
vysoce nenasycené mastné kyseliny (VNMK, PUFAs) tříd n-3 a n-6
Zdroje tuku
živočišné a rostlinné Mastné kyseliny
► s krátkým řetězcem - 6-12 C (SCFA) kys. máselná,propionová
► nasycené - 12 a více C kys. palmitová, stearová
► mononenasycené -16al8C, 1 dvojná vazba kys. palmitoolejová, olejová
► polynenasycené (PUFA) - 18 a více C, 2 a více dvojných vazeb
kys linoleová, alfa-linolenová - esenciální MK
syntézu lipidových mediátoru typu eikosanoidu, PAF a
sekundárních přenašečů diacylglycerolu a ceramidu. Lipidové mediatory ovlivňují produkci a funkci cytokinů. To má důležitý dopad na řadu imunitních a buněčných funkcí včetně proliferace, diferenciace a apoptózy
Triglyceride Htruclure- showing three íaíly acids attached to glycerol.
Imbalance v lipidovém metabolismu hraje roli u mnoha závažných onemocnění
► Vysoká hladina cholesterolu je spojena s kardiovaskulárními chorobami, které jsou nej častější příčinou úmrtí v populaci.
► Lipidy produkované buňkami imunitního systému jsou zahrnuty v zánětlivých onemocněních jako je revmatoidní artritída, sepse, astma, zánětlivé onemocnění střeva.
► Lipidy hrají úlohu také v psychických a neurodegenerativních onemocněních (deprese, schizofrenie, Alzheimerova choroba)
► Lipidy ovlivňují počátek a rozvoj nádorových onemocnění
Relativní procento různých mastných kyselin v potravě a změny způsobené průmyslovým zpracováním potravin
Hunter Gatherer |   Agricultural   | Industrial
40
E I
v:
+
o
\'i In min C
hüll
-4 x 10*
—i-r~
-10,000 1,800
Years
1,900
2,000
Fig. I. Hjpothetical scheme of fat, fatty acid (u>6* {&\ trans and total) intake (as percentage of calories from fat) and intake of vitamins E a Ltd C (mg/d). Data were extrapolated from cross-sectional analyses of contemporary hunter-gatherer populations and from longitudinal observations and their putative changes during the preceding 100 years [75].
YCiilM MCI MCkkHlM
MM VX% MCI M ZATéZ\ MII Iď
(Polyunsaturated fatty acids - PUFAs) - mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami. Tři hlavní skupiny PUFAs:
n-3 (omega-3), n-6 a n-9, podle polohy dvojné vazby nejbližší ke koncovému metylovanému uhlíku.
Tyto jsou metabolizovány stejným způsobem alternativními desaturačními a elonsačními enzymy.
NOMENKLATURA:
Např. kyselina arachidonová, 20:4, n-6 20 - počet uhlíků
4 - počet konjugovaných dvojných vazeb
n-6 - poloha první dvojné vazby od metylovaného konce molekuly Téměř všechny dvojné vazby jsou ve víceméně stabilní cis - konfiguraci. Živočichové nedovedou syntetizovat n-3 a n-6 PUFAs de novo ani nedovedou přeměnit jednu sérii v druhou.
Tyto ESENCIÁLNÍ MASTNÉ KYSELINY musí být obsaženy v potravě podobně jako vitamíny. Jsou životně důležité jako složka všech membrán a permeabilní bariéry pokožky a jako prekursory eikosanoidů a s nimi souvisejících látek, které hrají důležitou regulační úlohu ve tkáních.
Zdrojem isou rostlinné oleje (n-6 PUFA) a rybí olej (n-3 PUFA
VYSOCE NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (VNMK)
(Polyunsaturated fatty acids - PUFAs) - mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami. Esenciální prekurzorové kyseliny řady n-6 a n-3
CIL
rostl.oleje
18:2n-6
COOII
/WWWVW\
CHj COOH
Linoleic acid
—4-
cVvwwwwvC0ÜH
18:3n-6 l
20:3n-6
Dihomcvy-linolenic acid (DGLA)
A5 desaturase
~A6 desaturase Elongase
ctWv\=A=/W\A
t:ooH
\
20:4n-6
\
20:5n-3
Arachidonic acid (AA)
OOH
t
22:4n-6
i
22:5n-6
Elongase
Eicosapentaenoic acid (EPA)
'—;--
22:5n-3
. /W^oAc/WWV\
-L1'' COOJI
Doeosapenlaenoic acid (DPA)
Elongase, A6 desaturase and peroxisomal ß-oxidation
22:6n-3 /WWWWWWV
,COOH
Docosahexaenoic acid (DHA)
n-6 series
n-3 series
C1 WvAAWv/ C6 v
VVwWWW
\A/wVWWV'
4
WWWW\/
wwwww(
H,C-C-SCoA
C3
LNA c1\A^/vvwV
A6 desaturation
18:3 18:4
gtt,      elongation jM,
20:3 20:4
Jft,   A5 desaturation
20:5
EPA
^r elongation 22:4 22:5
jmL elongation ^
24:4 24:5
vvvv^aa/
VWV^A/V ^
\^v=v=s/=v=\w/^0-
/
A6 desaturation
24:5 24:6
jul partial (3-oxidation r
22:5
DPA
22:6
DHA
dooosatrienes *♦« resolvins », neuroprotectins
H.C-C-!
SCoA
r
Důležitý je poměr n-3: n-6 VNMKM!
Kvs. linolová (18:2, w-6)
kyselina arachidonová (AA, 20:4), rostlinné oleje
zdroj eikosanoidů (prostaglandiny, leukotrieny) význam u
různých nádorů.
V experimentálních systémech často podpůrný účinek pro vznik a rozvoj nádorů
Kvs. alfa-linolenová (18:3, w-3)
kys. eikosapentaenová (20:5) a dokosahexaenová (22:6) z rybích a některých rostl, olejů (pupalka, len, rakytník) V experimentálních systémech často inhibiční účinek pro vznik a rozvoj nádorů
r
včetně nádorových. Existují v zásadně dvě úrovně ovlivnění: změny složení mastných kyselin (MK) v buněčných membránách přímá kontrola procesů v jádře na úrovni transkripce genů
n-3 a n-6 PUFA jsou metabolický i funkčně odlišné. Jejich rovnováha je důležitá pro homeostázu a normální vývoj. Efekty jsou pleiotropní.
Zatímco proteiny jsou geneticky determinovány, složení buněčné membrány s ohledem na lipidy (a tím i řada buněčných funkcí jako je aktivita membránových enzymů a přenašečů, vazba hormonů, mechanismy signálové transdukce) je z velké části závislé na příjmu z potravy.
n-3 a n-6 PUFA mohou účinně a přímo řídit transkripci specifických genů (např. geny kódující lipogenní proteiny, delta desaturázy atd.).
Tak může příznivý a nepříznivý účinek tuků na různé choroby zahrnovat kombinaci interaktivních regulačních mechanismů:
► akutní, rychlá a přímá regulace exprese genů
► dlouhodobá adaptivní modulace složení membrán, která může přímo ovlivnit příjem a přenos signálů hormonů, cytokinů, produkci eikosanoidů apod
Během průmyslové revoluce se drasticky poměr n-6:n-3 PUFA
V tzv. zapadni dietě je dnes místo 1:1 az 10-25:1
Qfl
Epidemiologické studie - snížená incidence nádorů (kolonu) v populacích konzumujících velké množství (jú-3 VNMK z mořské stravy
Experimentální studie
• cjo-3 VNMK inhibují karcinogeny-indukovanou karcinogenezi
• redukují růst transplantovaných nádorů u laboratorních zvířat
• snižují proliferaci a indukují apoptózu u nádorových buněk kolonu in vitro.
Klinické studie - EPA a DHA
inhibují proliferaci epiteliálních buněk kolonu u pacientů s adenomy a vysokým rizikem nádorového onemocnění
_
Při chirurgických zákrocích
predoperační perorální nebo pooperační enterální či parenterální dieta s co-3 VNMK zlepšuje postoperační zánětlivou a imunitní odpověď a snižuje infekci.
Dieta s o)-3 VNMK zlepšuje nádorovou kachexii a kvalitu života
Kombinace se štandartní terapií
(chemoterapie, záření)
• dieta s co-3 VNMK netoxický způsob zvýšení účinků terapie
• samotné použití a)-3 VNMK užitečný přístup, jestliže je vyloučena toxická štandartní terapie.
J
3000i-
t—i—i—i—r—i—i—i—i—i—"I   r i—i—i—i—I—i
9   12 15  18 21  24 27 30 33 36 39 42 45 48 51  54 57 60
Days
Fig. 1. Effect ofdielary fally acids (corn oil, menhaden oil, golden algae oil)on Lhe growth of WiDr Lumor in aLhymic mice. Tumor weights were esLimaLed using Lhe formula (Lumor weighl in mg~ AX BX C/2) where A, B, C represent Lhe Lhree perpendicular diameleTS of the Lumor in millimeLers. Each daLa poim represems Lhe mean SEM from 5 Lo fi animals. P-values were compared Lo 24% corn oil. Label keys: ~4 P < 0.05; P < 0.01 al day 53; - 24% corn oil IreaLed; 8% com oil IreaLed; A4 8% corn oil and 16% menhaden oil IreaLed; O, 8% com oil and 16% golden algae oil IreaLed.
Kato T. et al., Cancer Letters 2002
rokázány změny ve složení a metabolismu lipidu
► v plazmě nádorových pacientů
► v nádorové tkáni a buňkách ve srovnání s nenádorovými
Zejména snížení obsahu co-3 VNMK (DHA) ve srovnání s co-6 (kys. linolová a arachidonová)
Integrovaný pohled na komplexní lipidové interakce, které určují výsledný tzv. LIPIDOM - lipidový profil jednotlivce.
S protekcí určitých typů nádorů (např. prsu) spojen složený indikátor kombinující zvýšené mononenasycené MK a nízký poměr omega6/omega 3 Tento lipidom by se mohl stát templátem pro detekci rizika nádorů prsu ve vztahu k dietě.
(Bougnoux P. et al, Diet, Cancer and Lipidome Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15, 2006)
r
MOLEKULÁRNI MECHANISMY působení w-3 VNM
► změny vlastností buněčných membrán (fluidita, lipidové rafty)
► suprese biosyntézy eikosanoidů odvozených od AA- změna imunitní odpovědi a modulace zánětu, proliferace, apoptózy, tvorby metastáz a angiogeneze
► ovlivnění signálové transdukce, aktivity transkripčních faktoru (NFkB, PPARy) a genové exprese - změny metabolismu, buněčného růstu a diferenciace
► změny metabolismu estrogenů - redukce estrogeny stimulovaného růstu
► zvýšená nebo snížená produkce volných radikálů (kyslíku, dusíku)
► mechanismy zahrnující citlivost k insulinu
Lipidový metabolismus
Aktivace fosfolipáz Uvolňování a metabolizace AA eikosanoidy
Transdukce signálů (kinázy, fosfatázy) Aktivace membrán, i vnitrobun. receptoru - tr. faktorů
Složky lipidového metabolismu v buněčných signalizacích Mediatory a modulátory
Exprese proteinů Exprese genů - mRNA
n-3PUFA LNA. DHA
n-6 PUFA LA, AA
LOX I I P450 I
[kyselina arachidonová
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony, _polutanty, záření)_
Korelace s cytokinetikou Posloupnost dějů
Phospholipid structure and the orientation of phospholipids in membrane
hydrophilic head
water
two hydrophobic fatty acid tails
<0
<0
to
phospholipid
bilayer, or membranel
phospholipid mofecule |Figure 2-22. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
11114551
Extracellular fatty acid carrier
albumin
i
diffusion ; "flip-flop" %
I
1
Fatty acid transporter and activator?
6 mammalian genes
fatty acid transport protein
CoA
fatty acid binding ^protein
9+ mammalian genes
protein mediated
acyl CoA La synthetase
5 mammatian genes
CoA
Intracellular Activates fatty acid carrier fatty acid
Proposed models for FA internalization in neurons. In the diffusion model of E\ internalization, FAs are released from albumin and, owing to their hydrophobicity, partition into the outer leaflet of the plasma membrane. The FAs then "flip-flop" from the outer leaflet to the inner leaflet of the plasma membrane, where they can dissociate or be extracted by FABPs or Ac si proteins. FAs bound to EABPs are ultimately transferred to Acsl proteins, which catalyze the reaction that converts the free FAs to their CoA derivative. The FA-CoA cannot repartition into the membrane owing to the presence of the hydrophilic CoA. Additionally, FA internalization may be mediated by EATPs. FATPs may increase the rate or efficiency of FA * flip-flop" or increase FA stability in the inner leaflet, which increases the opportunity for FAs to interact with either EABPs or Acsl proteins. It remains controversial whether FATPs themselves convert the FAs to their FA-CoA derivative.
FATTY ACID TRANSLOCASE (FAT/CD36)
Protein v plasmatické (mitochondriální?) membráně CD36 - multifunkční adhezní receptor pro trombospodin a kolagen a scavenger receptor pro LDL exprimovaný na plateletech, monocytech ale i jiných typech buněk.
Nově prokázána funkce při transportu VNMK i jeho přítomnost v
buňkách gastrointestinálního traktu (Lobo MVTetal., J Histochem Cytochem 2001, Campbell SE et al, J Biol Chem 2004, Drover VA, J Clin Invest 2005)
1 í
i i 1 HUUMMMUMUM
FA
Extracellular
Intracellular
FA-CoA
Fig. 1. Schematic representation o1 the membrane topology ol fatty acid (FA) transport protein.
et al., Proc Nutr So
3
(a)
t:
(b)
TGN "Zd* a
(c)
Golgi
TTTTftttAfTTTTTT
Lipid raft
Fig. 3. Proposed model for cellular tatty acid uptake. Fatty acid transport protein (FATP, _l), stabilization of lipid ratts (—) by acylated very-long-chain fatty acids (VLCFA) and fatty acid translocase (FAT)/CD36 incorporation into lipid ratts could cooperate to facilitate efficient long-chain fatty acid (LCFA) uptake. Intracellular VLCFA are esterified to their acyl-CoA and thereafter bound to sphingolipids in the outer leaflet of the biomembrane of lipid rafts. This process might indirectly facilitate on-demand' recruitment of FAT/CD36 from an intracellular compartment to lipid rafts located on the plasma membrane and result in augmented uptake of LCFA. TGN, trans-Golgi network; (If), caveolins; (m), fat; (—}, fatty acid; phospholipid; (C), cholesterol; (f ), sphingolipid.
37
Expression of CD36 antigen in HCT116 cells after treatment with AA, DHA, NaBt or their combinations
10°
1Q1
102
CD36-FITC (FL1]
103 Key Name
10« _ParJ
control control et AA50 DHA50 NaBt3
AA50+NaBt3 DHA50+NaBt3
I
FLll
flJ flJ
/I
FL1|
membrane bilayer
^íífřfflpi
Phospholipase A2
o
Prostaglandins	Leukotrien es and	Eicosanoids	▼ Eicosanoids		Leukotrienes and
series 1	Lipoxins series 4	series 2	series 3		Lipoxins series 5
H
H
R2
H
H
Phospholipase A2
O
H
0
R1
R3
0
Drug Discovery Today
Figure 1. Phospholipid structure with phospholipase A2 cleavage site.
Fosfolipáza A2
Enzym účastnící se lipidového metabolismu, důležitý pro řadu buněčných procesů.
Tři skupiny:
► sekretovaná PLA2 (sPLA2),
► na vápníku nezávislá PLA2 (ÍPLA2),
► na vápníku závislá cytosolová PLA2 (cPLA2).
Kromě úlohy v buněčném signálování souvisejí PLA2 s různými patologickými stavy, včetně zánětu, tkáňové reparace a nádorů.
U řady nádorů jsou hladiny sPLA2 a cPLA2 zvýšeny.
PLA2 jsou také cílem protinádorové terapie
sPLA2 v zánětlivé odpovědi
Prozánětlivé cytokiny indukují expresi sPLA2. Aktivační faktory uvolňují sPLA2 ze sekrečních granul do ECM. Za přítomnosti Ca2+ sPLA2 hydrolyzuje membránové fosfolipidy sousedních buněk. Uvolnění AA a následná tvorba eikosanoidů indukuje zánět.
Extracellular matrix
Drug Discovery Today
Figure 2. sPLA2 participating in an inflammatory response. (1) Pro-inflammatory cytokines such as tumour necrosis factor a (TNF-a) or inter leu kin 1J3 (IL-1JJ) induce cellular expression of sPLA2. (2) Activating factors cause release of sPLA2 from secretory granules into the extracellular matrix. (3) In the presence ot millimolar concentrations of Ca2\ sPLA2 hydrolyzes membrane-bound phospholipids ot neighbouring cells. Released fatty acids, such as arachidonic acidr are further metabolized into eicosanoids, generating an inflammatory response in neighbouring cells.
Drag Ds'scovory Today
Figure 3. Activation of cPLA2-ot. (1) Pro-inflammatory cytokines including tumour necrosis factor ot induce expression of cPLA2-a. (2) Activation leads to mitogen-activated protein kinase-pathway-directed phosphorylation of cPLA2-ot. (3) Extracellular influx or mobilization of intracellular stores of Ca2+ bring about cPLA2-« translocation from the cytosol to perinuclear membranes. This brings cPLA2-« in close proximity to both its substrate and enzymes involved with eicosanoid synthesis. (4) Activated cPLA2-« lyses membrane phospholipids providing arachidonic acid (AA) to a range of enzymes involved with eicosanoid synthesis, specifically COX and LOX.
Aktivace cPLA2
Prozánětlivé cytokiny indukují expresi cPLA2. Následuje fosforylace zprostředkovaná MAP kinázami. Ca2+ způsobuje translokaci cPLA2 z cytosolu do perinukleární membrány, kde je také její substrát a enzymy nutné k tvorbě eikosanoidů. Aktivovaná cPLA2 lyžuje membránové fosfolipidy a uvolňuje AA, která je metabolizovaná COX a LOX.
Pro-inflammatory cytokine ^
(e.g.TNF-a)
Drug Discovery Today
Figure 4. Model of constitutive overexpression of cPLA2 and COX-2 in tumour cells (reviewed in [4]).
Interakce n-3 PUFAs s AA při syntéze eikosanoidů s prozánětlivou aktivitou
kyselina linoleová (LA) (18:2 n-6)
metabolismus
kyselina arachidonová (AA) (20:4 n-6)
kyselina linolenová (LNA) (18:3 n-3)
DIETA
metabolismus
TXA2    PGE2   LTB4, LTC4, LTD4
faktor agregace destiček
mediatory zánětu
kyselina eikosapentaenová (EPA)
(20:5 n-3)
TXA3     PGE3    LTB5, LTC5, LTD5
slabší faktor agregace destiček
slabší zánětlivá aktivita
r
Cyklooxygenázové dráhy
kyselina arachidonová
COX-1 konstitutivní
COX-2 indukovatelná
aktivace
inhibice
endotoxin
cytokiny
mitogeny
glukokortikoidy
selektivní inhibitor COX-2
žaludek
střevo
ledviny
krevní destičky
místa zánětu
- makrofágy
- synoviální buňky
Cefi surface
Fig. 5. The EP1 receplor signals via coupling lo an as yel uncharaclerised G prolein. The blocked arrow indicates ihe potential inhibitory effect on PGE2 signalling through a variant EP1 receplor such as found in the rat (see text).
Přenos signálů PGE2 prostřednictvím receptoru EP1 - 4
S. Chell etal / Biochimica et Biophysics Acta 1166 (2006) 104-119
PGHZ
Prostaglandin E Syntheses
I
FPT Signalling
EP4 Signalling
Cytoplasm
CA^IP3
ATP
CAM P JL PKA pERK Akt
Fig. 4. PGE:can signal] through any single (or combination of)hlJ receptor. Signalling depends upon the enzymatic machinery andrecep tors present in the tissue or cell type in quesli on. Signalling via the EP1 receptor suhlype activates IP3 and mohil ises i nlracell ular Ca:+, through an as yet uncharaclerised G protein [110]. The EP2 and EP4 receptors activate adenylyl cyclase activity through binding Gs proteins (EP4 also has the capacity to modulate M APK signal cascades). The predominant EP3 receptor splice variant (of which four have heen identified in humans) induces the inhihilion of adenylyl cyclase, and hence inhihils cAMP activation, although this receptor suhlype can also couple to Gs and G12. Attows indicate activation by phosphorylation, whereas blocked anows indicate inhihilion of aclivalion.
COX-2 i 5-LPO stimulují buněčnou proliferaci, inhibují apoptózu a indukují neoangiogenezi
Cancer cell
prriÉfemtion
COX-2
5-LO
Apoptosis
oo oo
COX-2
5-LO
1
1 Ojp
Neo - angiogenssís     QOX - 2
5-LO
I
I
Table 1. 00X2 expression in malignant or premalignant human tumours
Premalignant or malignant lesion	COX2 expression {%)
Colorectal	80-00
Gastric	80
Oesophageal	70
Hepatocellular (liver cirrhosis)	54(81)
Pancreatic	67
Head and neck	80
N on-small-cell lung cancer	70
Breast (ductal carclnorna-ln-sltu)	40 (60)
Prostatic	83-03
Bladder	86
Cervix	43
Endometrial	37
Cutaneous basal cell	25
Cutaneous squamous cell	80
pPNET	100
Glioblastoma multiforme	71-74
Anaplastic astrocytoma (low grade)	44 (30)
References available at http://lirage.thelancet.com/extrajsy03oncl205webfr
log (rcM ratio, COX-2/1)
— O
_1_
_I
lurniracoxib
rofecoxib etoricoxib vald^coxib
do do lac meloxi cam
celecoxib diclofenac
sulindac meclofe-iiamate tomoxiprol I piroxieam diflunisal sodium salicylate niflumic zomepirac fenoprofen amp yr one ibuprofeai tolmetin naproxen aspirin indomeUiacirt
ketoprofen suprofen flurbiprofen ketorolac
o q
£5.
—+■
i—^ ■
4"
9 * o q
■ s
r
I
ecnanismy uciiiku exprese luä-z na vyvo kolorektálních nádorů:
■
Účinky nezávislé na produkci prostaglandinů (PGE2): Aktivace karcinogénu Produkce malondialdehydu Redukce hladiny volné AA
r
Účinky závislé na produkci PGE2: Indukce buněčné proliferace Inhibice apoptózy Indukce angiogeneze Zvýšení buněčné motility Zvýšené metastatického potenciálu Indukce lokální imunosuprese
rlodel interakce mezi nádorovými buňkami, endoteliálními buňkami a inílitr lijícími zánětlivými buňkami v místě nádoru
r
Úloha COX-2, PG a prozánětlivych molekul v angiogenezi_
T Angiogenesis factor secretion í COX-2 and PG production T antí-apoptotic factors
-From constitutive low expression of COX-1 from all cell types
-From transient high expression COX-2 from inflammatory cells and tumor cells.
Angiogenesis factors
how much ? qQ ®&
T Migration
T Permeability
f Neouascular formation
Pro-inflammatory molecules
-positive feedbacks increase the secretion of pro-inflammatory molecules
Fig. 1. COX-2 in angiogenesis, 'this figure models the interactive relationship among cancer cells, endothelial cells and infiltrating inflammatory cells at the site of tumor i gene sis. The prostaglandin pool is contributed to by all three different cell types and occasionally stromal cells. The positive feedback through prostaglandin receptors increases COX-2 expression and ensures the continued generation of prostaglandins. Jn the cancer cell, prostaglandin signaling also results in the production of multiple angiogenesis factors, through which they stimulate nco vascular formation tit the site of tumorigencsis, Jn inflammatory cells, prostaglandin signaling stimulates the generation -of pro-inflammatory molecules such as IL-2, which further recruits additional circulating monocytes and amplifies the inflammatory response. Asa response to increased levels of prostaglandins, angiogenesis factors and pro-inflammatory molecules, endothelial cells proliferate, mi gride and undergo tubal formation, providing additional nutrients for oncogenesis as well as a potential route for metastasis.
ÚČINKY INHIBICE CYKLOOXYGENÁZ A LIPOXYGENÁZ NA
NÁDOROVÉ BUN. POPULACE
Řada nádorů má změněný metabolismus nenasycených MK a produkuje zvýšené množství metabolitů AA, které indukují růst a invazivitu (epiteliální nádory - prsu, kolonu, plic, prostaty)
• Frekvence exprese jednotlivých typů enzymů (COX1, COX2, 5-, 12-15- LOX, FLAP, P450) se liší podle typu a histologického stupně nádoru
• Mitogenní a viabilitní faktory (EGF, HGF atd.) a prozánětlivé cytokiny (TNF-a, IL-1) indukují uvolňování AA a tvorbu eikosanoidů, které slouží jako přenašeče nebo modulátory signálů regulujících proliferaci a apoptózu
• Nesteroidní antiflogistika (NSAID - aspirin, sulindac, indometacin, ibuprofen , Piroxicam) inhibují aktivitu COX a mají preventivní a terapeutické účinky na rozvoj nádorů, zejména kolonu - využití inhibitorů COX2 (inducibilní)
• NSAID - snižují proliferaci a indukují apoptózu mechanismy závislými i nezásvislými na aktivitě COX
• Účinky mohou být přímé nebo nepřímé - zprotředkované např. změnami aktivity imunitního systému
• Inhibitory LOX (NDGA, esculetin, MK-886) inhibují proliferaci a indukují apoptózu řady nádorových linií
• Produkty 5-LOX fungují jako „second messengers" řady růstových a viabilitních faktorů
• Produkty 12-LOX se uplatňují v procesu invaze a tvorby metastáz - ovlivnění exprese proteáz, adhezívních molekul - využití inhibitorů
oieKuiarni mecnamsmy
Ceil membrane
cAMPor Ca2+
Fig, 4, Molecular media 11 isms forCOX-2 and NSAJDs, The right part of the model illustrates the prostaglandin synthesis pathway as well astlic subsequent receptor signaling the specific prostaglandin receptors as well as the non-canonical EGF receptor pathway. As the result of inhibiting COX enzymes, accumulation of amchadonic acid would directly promote apoptosis and attenuation of positive feedback to proliferation and survival through receptors The rest of the figure demonstrates sever til COX-2 independent mechanisms proposed for NS AJDs, Since, not all NSAJDs arc able to act through these mechanisms in every cell type, a brief tabic is attached to summarize the particular NSAJDs used in each experiment as well as the cell lines involved.
Microarray analýza oaoo-^ buněk po působení DHA (48h)
Indukované geny Reprimované geny
Fig.. 2. A, scanned image of hybridized human oligoarrays containing 3.8 k gen«. Total RNA from CaCo-2 cells, treated with DHA for 48 h, was used for inicroarray analysis as described in "Materials and Methods." A rsd color image of spors represents induced genes, gr&en spots indicate repressed genes. 3, scatter plot view of gene expression. Expression intensity Cy5 :Cy3 ratios of
untreated versus DHA-treated CaCo-2 cells. The ratios (Cy-5:Cy-3) of genet that have 2-fold expression are considered induced, and those with ^0.5-fold expression are considered repressed. Approximately 504 of 3800 genes (13%) were expressed in DHA-treated cells.
Control - gapdh nf-kB p50
LUJJ ínos
^ľj COX-2 ,"1 NF-kBp65
PPAR u
-■c
— H
3 RXR
__P53 induced protein
-nil AP2
_h_I Bcl2 ZZJ P27
__,_ P21(WaM/Cip1)
J PGE R1
Fig. 3. RT-PCR validation of selected genes listed in Table l. Differential expression of potential molecular targets modulated by DHA in CaCo-2 cells is shown on 2% agarose gel.
aravanan BA et al., Cancer Res 2003
	Docosahexaenoic Acid		
			
			
COX-2* Other Proinflammatory
Genes
iNOS i Apo ptosis
1
L- Mre^le rJ
Pig. 6. Effect of DHA on lNGS-posirive and apoptotic cells. Percentage of apoptolic cells was determined by DAFI staining. DAJI-positive celU with characteristic nuclear conden^a:ion and DNA strand breads for apopto^is were counted from 10 identical fields using a fluorescence microsccpe (Olympus) ^vith X40 iriagnification; bars, ±SD.
p27 T
CaspasBS 3
Differentiation
Apoptosis
Potenciální molekulární mechanismy působení DHA na nádorové buňky kolonu
Narayanan BA et al., Cancer Res 2003
Peroxisome proliferators (fibrates, phtalates, etc.).*
9-c/s-RA
Nutrition
PPAR
Fatty acids (PGJ2, LTB4)
H Y^RXF
IppRE^A/1 Target genes Transcription_*
Proliferation
CELL SPECIFIC RESPONSES
Differentiation and maturation
Apoptosis
* Clonal expansion of preadipocytes promoting adipogenesis (participation on PPARy.)
* Hypothetical risk in man of cell growth stimulation by activation of PPARs.
MEDICAL RELEVANCE
* Monocyte / macrophage differentiation (implication of PPAR7) leading to accelerated atherosclerosis.
* Protective effects of PPARa.
* Adipocyte differentiation responsible of obesity and other related disorders (implication of PPARa.)
* Enhanced PPARg expression could lead to tumoral cell apoptosis and represents a therapeutical approach in malignant disease.
Importance of PPARs in cell proliferation, differentiation and apoptosis.
After activation, PPAR and RXR form heterodimers which bind to DNA regulatory sequences of target genes through interaction with PPRE. The control by PPARs of the transcriptional activity af target genes gives rise to biological effects which may have consequences for human health. LTB4, leukotriene B4; PGJ2, prostagladin J2; PP, peroxisome proliferator; PPAR, peroxisome prolifera-tor-activated receptor; PPRE, peroxisome proliferator responsive element; 9-cis-RA, 9-cis-retinoic acid; RXR, 9-cis-retinoic acid receptor.
PP
Table 1. Possible mechanisms for the protective action of dietary fibre on colorectal oncogenesis
Physical
Increased bulk and dilution of carcinogen Decreased contact time due to more rapid transit Binding of carcinogen Binding of bile salts
Pre hi otic and metabolic action of flora
Alteration of colonic micro flora; numbers and species balance Inhibition of carcinogen activation Stimulation of flora to increase bulk
Alteration of bile salt metabolism to reduce conversion to secondary bile salts
Fermentative
Lowering of pH
Reduced solubility of bile salts
Increased production of SCFAs, especially butyrate
Metabolic
Reduced insulin resistance and hyperinsulinaemia
stné kyseliny s krátkým řetězcem- BUTYRAT
► produkován anaerobní mikrobiální fermentací vlákniny ve střevě
► zdroj energie pro normální kolonocyty
► významný pro udržení homeostázy ve střevní tkáni regulací exprese genů spojených s regulací proliferace, diferenciace a apoptózy (microarray analýza - změny exprese 19 400 genů), exportní protein MCT1
► butyrát sodný (NaBt) snižuje proliferaci a indukuje diferenciaci a apoptózu neoplastických kolonocytů in vitro a in vivo
Prevence NÁDORŮ TLUSTÉHO STŘEVA
rhe effects of butyrate in the colon epithelial celk during adenoma-carcinoma transition
Normal
Mucosa
zx:
Hyper-proliferation
Early Adenoma
Intermediate Adenoma
Late Adenoma
Carcinoma
Metastases
Stimulation of proliferation in the basal crypt
Inhibition of proliferation in the upper cry p I
Induction of apoptosis
Inhibition of proliferation Stimulation of differentiation
Hyperacctylation of histories
Alterations in gene expression P!flfccts on extracellular matrix
Regression of carcinomatosis in vivo
(aĽcUttc, propionate, butyrate)
(butyrate)
(butyrate)
(butyrate, propionate) (butyrate)
(butyrate) (butyrate)
(interleukin-2 + butyrate)
G2
ALKALINE PHOSPHATASE E-CADHERIN PROTEIN F-ACTIN (Stress fibers)
Inhibice proliferace - blok v G1 nebo G2/M, indukce p21, Cyklin D1,D3, downregulace c-myc Indukce diferenciace a apoptózy - genové arrays Inhibitor histon deacetyláz - změny exprese genů Ovlivnění specif. kináz, aktivace PPAR gamma, inhibice NFkB Inhibice c-Src, FAK, iNOS, COX-2
o
Proliferated cell
Growth inhibition &
arrest in G1-phase of the cell
TIME OF BUTYRATE TREATMENT
3 5 7
Period of culture (d)
I Fig. 1. Dose-dependent inhibition of rat non-tumoural intestinal epithelial cells (IEC-6) by butyrate as assessed in vitro, Cells were cultured without (0; control) or with butyrate       0-5 mM;      1 mM; A5 2 mM;     5 mM) and cell number was measured after 31 5 and 7 d.
Short-chain fatty acids
Butyrate
C-myc
Cyclin P3?
LE2J DP Rb
E2F DP
Fig. 4. Overview of the different pathways leading to inhibition of cell proliferation and the blocking of the G1 stage of the cell cycle (for details, see p. 104). NF-kB, nuclear factor kappa B; Rb, retinoblastoma protein; cdk, cyclin-dependent kinases; p21/cip1, a member of the Cip/Kip family which bind to the cyclin-cdk complex to inhibit its activity; Tob1 (APR06), a member of the anti-proliferative family APRO, members of which control cyclin D1 transcription.
et aL Proc.Nutr. Soc. 2003
VÍCE, NEŽLI JEN ZDROJ ENERGIE!!!!
♦ strukturální a regulační úloha
♦ dopad na fyziologické funkce organizmu
► účinky na imunitní systém
► regulace proliferace, diferenciace a apoptózy
► úloha v karcinogenezi
(etiologie nádorů tlustého střeva, prostaty, prsu)
í kaboratory
^^ofl ytekinetic
r
Spolu s cytokiny a hormony fungují jako intra- i intercelulární mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě
Poměr obsahu cj-6 a co-3 esenciálních vysoce nenasycených mastných kyselin (VNMK) ovlivňuje vlastnosti membrán, zejména jejich fluiditu a produkci látek vznikajících hydrolýzou membránových fosfolipidů.
Tyto změny pak ovlivňují vazbu cytokinů, aktivitu receptoru i funkci na membránu vázaných signálních molekul (G proteinů fosfolipáz atd.).
r
Patologické změny v produkci a funkci cytokinů a eikosanoidů přispívají k rozvoji nádorových onemocnění zejména ovlivněním imunitního systému a buněčné kinetiky
Metabolismus a obrat fosfolipidů v membránách
i oxidatívni metabolismus nádorových buněk se zásadně liší
od buněk nenádorových.
Nádorové buňky kolonu vykazují:
♦ změny ve spektru a koncentraci VNMK ve srovnání s normální tkání
♦ zvýšenou periferní utilizaci VNMK z potravy
♦ změny v oxidativním metabolismu a antioxidační ochraně
♦ zvýšenou aktivitu enzymů metabolismu kys. arachidonové (COX2, 12-LPO...) a produkci eikosanoidů
♦ sníženou citlivost k endogenním inhibitorům růstu (TGF-p1), induktorům apoptózy (TNFoc, FasL, TRAIL) a diferenciace (butyrát)
YTOKINY
Důležité endogenní faktory ovlivňující kolorektální karcinogenezi TNF-family (TNF-a, Fas ligand, TRAIL-TNF relating apoptosis inducing factor)
TGF-family (TGF-P)
EGF - epidermální růstový faktor
Tumour necrosis factor-alpha (TNF- a), interleukiny
► multifunkční cytokin
► jeden z hlavních mediátorů zánětu
► TNF- a je produkován makrofágy a dalšími buňkami imunitníhp systému
► koncentrace TNF- a v kolonu je zvýšena během chronického zánětu (ulcerativní kolitida nebo Crohnova choroba)
► úloha v nádorové kachexii
► existuje interakce mezi cytokiny a dietetickými faktory - mastné kyseliny a eikosanoidy
výživový status
proteiny lipidy vitamíny minerály
infekce
zánět
neoplazie
produkce a uvolňováni cytokinů
lipidové mediatory
PG LT atd.
biologická funkce cytokinů
imunitní odpověď
odpověď akutní fáze horečka anorexie
změněný metabolismus
Vzájemné vztahy mezi výživou a infekčními a zánětlivými chorobami zprostředkovanými cytokiny
potentiation effects
cycloheximide actinomycin D
IFN gamma
TNF-oc
TNFR1 R2
n n
INTERACTIONS OF DIETARY FACTORS AND ENDOGENOUS REGULATORS SUPPOSED TO AFFECT
CYTOKINETICS OF COLONIC EPITHELIAL CELLS
GUT-LUMEN
APOPTOTIC CELLS
DIETARY PUFAs		DIETARY
(n-3, n-6) |^		FIBRE
\ EPITHELIAL CELLS
.5 1
CRYPT
CYTOKINES (TNF-a, FasL, TRAIL)
PROLIFERATIVE PART
PAHs cytostatika
gut-wall
Hofmanová J. et a. Eur J Nutr 2005 Hofmanová J. et al. Cancer Letters 2005 Vaculová et al. Cancer Letters 2005
r
ZMENY BIOFYZIKALNICH VLASTNOSTI
BUNĚČNÝCH MEMBRÁN
► provázejí procesy diferenciace a apoptózy savčích buněk
► pozorovány rozdíly u
• nádorových a normálních buněk
• nádorových buněk senzitivních a rezistentních k cytostatika m
► souvisejí do značné míry s modulacemi ve složení struktuře, symetrii a metabolismu buněčných lipidů.
5
Detekce těchto změn a jejich korelace s dalšími parametry odrážejícími diferenciaci a apoptózu
přispívá k objasnění
• posloupnosti a regulace jednotlivých kroků těchto dějů
• rozdílů mezi normálními a nádorovými buňkami
příčin rezistence nádorových buněk k terapii
r
DETEKOV
♦ strukturální změny lipidů v bun. membránách, tzv. „lipid packing" (merocyanine 540, FCM)
♦ membránový potenciál (DÍOC5, FCM)
♦exprese transportního proteinu pro mastné kyseliny - FAT/CD36, MCT1 (FCM)
♦akumulace triglyceridů (lipid droplets) v cytoplazmě buněk (Nile red, FCM) ♦změny mitochondriálního transmembránového potenciálu (TMRE, FCM) ♦produkce reaktivních kyslíkových metabolitů -ROS (DHR-123, FCM)
CYTOKIN ETIKA
Proliferace - počty buněk, buněčný cyklus, regulační proteiny Diferenciace - aktivita alkalické fosfatázy (ALP), CEA, E-kadherin, F-aktin Buněčná smrt (apoptóza)- viabilita, % plov.buněk, subG0/G1, MMP, Apo2.7, kaspázy, štěpení PARP, Bcl-2 rodina, morfologie jader (DAPI)...
r
•7*1 KI Sfcl tfi! 141
1
♦ Fluidita membrán - polarizace fluorescence TMA-DPH (trimethylammonium diphenylhexatriene)
♦ Analýza fosfolipidů a spektra mastných kyselin
Celé buňky, membránová frakce, mitochondrie (kardiolipin)
♦Detekce specifických typů lipidových molekul
(ceramid, eikosanoidy.......)
♦Lipidový metabolismus - inhibitory AA, exprese a aktivity spec. enzymů (PLA, COX, LOX,....), Oxidatívni metabolismus - produkce ROS, NOS peroxidace lipidů,
glutation, enzymové aktivity - iNOS, MnSOD atd
r
MEROCYANIN 540 (MC540
► Lipofilní, negativně nabitý heterocyklický chromofor m. v. 570 D, používán ve fotodynamické terapii
► Váže se preferenčně na biologické membrány a lipozomy a je citlivý ke strukturálním změnám lipidů
► Rozsah vazby a následně intenzita fluorescence je ovlivňována
• změnou tzv.Jipid packing" membránovým potenciálem přítomnosti séra, pH a iontovou silou
VYUŽITÍ MC540
1
Pomocí MC540 lze monitorovat
► strukturální změny membránových fosfolipidů (změny asymetrie) během proliferace, diferenciace a apoptózy
► jemné rozdíly membránových lipidů u podobných buněk (nádorové vs. nenádorové, senzitivní vs. rezistentní)
FL-2
"looser lipid packing" (rozvolňování) 4 zvýšená fluorescence
"more tight packing" (upevňování)   ^ snížená fluorescence
Tří a cyl glycerols and cholesteryl esters
LIPID DROPLETS
AKUMULACE LIPIDŮ V CYTOPLAZMĚ
Nile Red
► akumulace lipidových kapének (lipid droplets) v cytoplazmě buněk (působení lipidových látek, indukce diferenciace a apoptózy)
► obsahují neutrální lipidy (obvykle triacylglyceroly nebo estery cholesterolu)
za normálních podmínek - zásobárna energie a cholesterolu
► souvislost s regulací procesů diferenciace a apoptózy není zcela objasněna
► fluorescenční barvivo Nile Red (FL-1 a ) citlivé vitální barvení lipidových kapének
r-
Box 2 I Intracellular cholesterol regulation
Early sorting Late endosome endosome
in
y' b
y Lipoprotein p hydrolysis
/"\ f ] i   / C
Cholesterol
synthesis /' \
*........+ (   LD )d
\^ Cholesterol storage
LDL receptor
— LDL 3 Lipoprotein uptake
CT
f Recycling endosome
Plasma membrane
€ Cholesterol efflux
Law freG cholesterol
High free cholesterol
Martin S. and Parton RG, Nature Rev
Cytosol
TriacylglyceroLs and cholesteryl esters
i = 0 min
PAT protein
Figure 11 The formation of lipid droplets, a |The formation of lipid droplets [LDs] as monitored by th e use of a cave o LI n -t runcat io n- in u ta n t-g re e n-f lu orescen t- prote in fusio n p rote i n (C a v 3 DGV-C F P). Befo re fatty ac id add ftfon [t = 0 m in ]. Cav 3 DGV-C FP Loca llzes to the e n doplasmic retfc u lu m (ER) and GoLgl region {the image has been inverted to show dark staining for GFP). After fatty acid addition, LDs a pp ear th roug hout the ce 11 with in m in utes (the t = 30 min i mage is shown here}. For a movie of this process, see the Further info rmatlon. b 11 n the current model of LD formation, neutral Lipids are sy ntheslzed betwee n the Leaflets of the ER membrane. The mature LD is then thought to bud from the ER membrane to form an independent organelle that is bounded by a Limiting monolayer of phospholipids and LD-assocfated proteins. Some of the best understood LD-assocfated proteins are members of the PAT [perl LI pin. ADRP and TIP47- related proteln]-domain family of proteins. Part a modified with permission from REF. 8 ©(2004] The American Society for Cell Blolo<
t = 30 min
r
IPIDOVÉ RAFTY
malé oblasti proteinů a lipidů v membráně s unikátním
složením lipidů - bohaté na cholesterol.
Tyto struktury jsou funkčně zahrnuty
v kompartmentalizaci, modulaci a integraci buněčných
signálů a tak modulují důležité procesy jako
buněčný růst, přežití a adhezi.
VNMK jsou základní složkou lipidových raftů a předpokládá se, že např. DHA může částečně působit zvýšením fázové separace lipidů v membráně. Strukturální integrita LR a caveolae jsou základní pro příjem VNMK. Caveolin-1 a FAT/CD36 jsou vázány v LR
Lipids
Glyceryl p hos p hatldyllnosltol (G PI)
Proteins
Cholesterol
O Carbohydrate
Figure 2 | The Fluid-Mosaic-Model of the cell membrane. Like a mosaic, the cell membrane is a complex structure made up of many different parts, such as proteins, phospholipids and cholesterol The relative amounts of these components vary from membrane to membrane, and the types of lipids in membranes can also vary.
Liquid-ordered phase
Liquid-disordered phase
Free energy is directly proportional to the boundary length
Fig* 2 I Mismatch of liydrated phospholipids and the intercalation of cholesterol as a driving force for a phase separation into liquid-ordered and -disordered phases. (Figure courtesy of P. Kinnunen.)
Modulace lipidů (DHA)- lipidové rafty - modulace signálů TNFR
fail
Fas
TCR
Fail
TNFR1
chüj'cslercf ť/apJarfon
Non-raft
FAD?
Caipase-B i
Lipio1 re*
Monarneric řoi   P'Miiociaitd Fas ftp* II! CTrf» II
iniofesfEroJ
Poor cos pa s a activation
No Ceil Dearh
Caspare activation
Cell Death
M Q n-rafl
clAPI
.0
Lipid raft
poor NF-kB acti/atrem
	NF-kB
	□ tMration .
Cell Death
Bloťkado oF ca spase-8 activation, A rrrl-opo ptosis. Inflammation
Figure 2. Examples of How Lipid Rafts Can Modify Early Events in TNFR Family Signaling
(A) in activated CD41 T cells, Fas is excluded from lipid rafts, outside of lipid raits, Fas is likely to be monomerlc. After engagement by FasL, although FA.DD and caspase-8 are recruited to Fas, they do not signal efficiently for death Upon TCR restlmulatlon, Fas translocates Into lipid rafts where it tends to preassoclate. Within lipid rafts, upon FasL binding, FADD and caspase-8 are recruited to Fas where caspase-8 can autoactivate and trigger cell death.
(B) Upon TNF binding, TNFR1 translocates Into lipid rafts whoroln complex I formation takes place and results In the activation of NF-kB. Through mechanisms described in Figure 1, NF-kB can inhibit caspase activation within conplex II. When cholesterol Is depleted, lipid raft structure Is dlsnpted and complex I forms outside of lipid rafts and cannot signal efficiently for NF-kB and therefore cannot inhibit death Induced by complex II. The thickness of the arrows indicates relative efficiency of each signaling pathway.
NI
Složení a využití lipidových emulzí
Směsi přírodních olejů (sojový -LCT, kokosový - MCT), emulgované fosfolipidy (vaječný lecitin, sojové fosfolipidy), izotonizační přísada (glycerol)
Tukové částice podobné chilomikronům
Parenterální výživa - emulze součást tzv. „all-in-one" vaků
Funkce - zdroj energie a esenciálních MK
Na základě nových poznatků o regulační úloze lipidů využití jako f ar maka
Enterální a orální výživa Nutrition pharmacology Disease-specific nutrition
složení mastných kyselin v membránových fosfolipidech molekuly membránových fosfolipidů třídy membránových fosfolipidů
fluidita membrán
interakce ligand - receptor
funkce G-proteinu
funkce fosfolipáz A2, C, D
funkce ty ros i n kináz, fosfatáz
hladiny intracelulárního Ca
molekuly DAG
molekuly fosfatidové kyseliny
funkce protein kináz např. PKC
funkce proteinových fosfatáz
další signální systémy např. přes cAMP, cGMP
funkce transkripčních faktorů
steroidní hormony
r
Oxidatívni stres jako mediátor apoptózy
Mnoho látek, které indukují apoptózu jsou buď oxidanty nebo stimulátory buněčného oxidativního metabolismu. Naopak řada inhibitorů apoptózy má antioxidační účinky.
Možné mechanismy:
► Bcl-2 protein (produkt bcl-2 onkogenu) - v mitochondriích, endopl. retikulu a jaderné membráně - regulace ROS
► Aktivace poly-ADP-riboso-transferasy a akumulace p53 -polymerizace ADP-ribosy s proteiny vyúsťuje v rychlou ztrátu zásoby NAD/NADH, kolaps zásob ATP a smrt buňky.
► Oxidace lipidů v bun. membránách - mediátory apoptózy HPETE (po působení TNFoc)
► Aktivace genů odpovědných za apoptózu přes aktivaci specifických transkripčních faktorů jako je NFkB - rozporná úloha.
► AP-1, antioxidant-responsivní faktor může také přispívat k regulaci apoptózy.
Fyziologicky se ROS se tvoří v:
Peroxisomech - rozklad mastných kyselin (MK) - peroxid Kataláza využívá peroxid v detoxifikačních reakcích
Mitochondriích - respirační cyklus a katabolismus MK. Mn Superoxid dismutasa
a další antioxidanta v mitochondriích udržují nízkou hladinu těchto ROS.
Byla prokázána silně inverzní korelace mezi produkcí ROS mitochondriemi
a délkou existence savčího druhu. Mikrosomální systém transportu elektronů (cytochrome P450) - vyžaduje
elektrony z NADPH k produkci částečně redukovaných kyslíkových druhů.
ROS vznikají jen za přítomnosti selektovaných xenobiotik - superoxidový
radikál - konverze na reaktivnější hydroxylový radikál Mimobuněčné děje - oxidatívni vzplanutí aktivovaných makrofágů - NADPH-
oxidáza -Superoxid. Antioxidační obranný systém:
► neenzymatický: molekuly jako vit E, vit C a glutation působící přímo na ROS
► enzymatický: Superoxid dismutáza (SOD), kataláza (CAT), GSH peroxidasa (GSH-Px) a GSH S transferasa (GST). Mohou buď přímo odstraňovat ROS nebo působit recyklaci neenzymatických molekul.
xiaativni sires
Aktivace karcinogénu
Trvalý oxidatívni stres
Poškození DNA: změny struktury a mutace genů
Inhibice mezibuněčné komunikace
Abnormální genová exprese
Abnormální enzymatická aktivita
Rezistence k chemoterapii
Buněčná proliferace
Aooptóza
Dědičné mutace
Expanze klonů
Metastáze a invazivita
Iniciační stádium
Stádium promoce
Stádium progrese
Table L  Mediators of Oxidative Stress
Reactive Oxygen Species Free radicals
Hydroxy I radical (HO] Superoxide radical (O2-)
Nonradicals
Hydrogen peroxide (H2O2) Singlet oxygen f^Og)
Lipid Peroxidation Products
Peroxyl radical (ROO-) Alkoxyl radical (RO-)
Secondary Products
Mai o ndi a Idehyde 4- Hydroxy al ken a Is
J
r
Příklady a mechanismy působení vysoce nenasycených mastných kyselin třídy n-6 a n-3
Experimentální systémy in vitro a in vivo Působení n-3 vs. n-6 MK
Působení na proliferaci a smrt normálních a nádorových buněk Interakce s růstovými faktory
Spolupůsobení s jinými agens (cytostatika, chemoterapeutika)
Metabolismus kyseliny arachidonové Úloha cykloogygenázy 2 Inhibitory metabolismu AA v terapii
Časový průběh účinků kyseliny eikosapentaenové (n-3) na buňky
P U FAS INDUCE APOPTOSIS
□ Peroxidation (ratio)
O % Dead (EPA}
A % Apoptotic (EPA)
■ Biomass (ratio)
• % Dead (control)
A % Ap Optot rc (con t ro!)
Peroxidation [ratio)
EPA / CONTROL RATIO .25
TIME (hours)
Suprese růstu buněk nádoru prsu EPA a DHA
1 ig. 2. Suppression nf gnputh yf | lie Mf)A MBO.1l breast cancer cell line b> EPA (•} and DMA |Oj. Points, mean vaJues tor triplicate wells; Afltt, SE- C eil number reduced Minifies HI J> Cfimpsirrd with control: mP < 0 05. "P < 0.01.
Účinky LA a OA na růst buněk nádoru prsu
5 -
Q.OO   0P50   1,00   1.50   200 2.50
Fig. I. The effects uf LA (O) and OA f») on growth of the MDA-MB-231 breast cancer cell line. The cells were counted after 6 days. Culture was in scrum-Tree medium containing L25 mg/ml of dciipidized BSA, and the J As were Lidded dissolved in ethflnoh An CQual volume of ethnnol was added to the control wells. Points, mean values for triplicate wells; burs, SkP Statistically significant differences in cell numbers Compared *ith those in the absence of FA addition are;