5 1 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr Časově rozlišená fluorescence 18.10.2007 5 2 Ustálená a časově rozlišená fluorescence * Ustálená fluorescence (Steady State) se měří při buzení kontinuálním zářením a dostáváme potom časovou střední hodnotu intenzity či polarizace fluorescence. * Časově rozlišená fluorescence se měří pomocí pulzní excitace (délka pulzu je obvykle kratší než doba dohasínání fluorescence vzorku) nebo fázově modulovaného budícího záření a umožňuje analyzovat časové závislosti měřených parametrů. 5 3 Proč měřit časově rozlišenou fluorescenci? * Udává nám informaci o poklesu intenzity fluorescence v čase * Měření je relativní, často nezáleží na skutečné hodnotě intenzity * Je závislá na vlastnostech okolí * Dává informace o dynamice ­ rotaci molekul 5 4 Časový průběh fluorescence * Nejjednodušší je exponenciální pokles pro sférické částice t eII t = 0)( 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 -2 0 2 4 6 8 10 12 time (ns) 0I I 5 5 Čas dohasínání fluorescence * je střední doba mezi excitací molekuly (tj.absorpcí fotonu) a emisí světla při návratu molekuly do základního stavu Jaká je intenzita fluorescence v čase po absorpci fotonu? t eII t = 0)( Doba dohasínání = 2 ns, potom v tomto čase t = má fluorescence 37% z intenzity než jakou měla čase 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 -2 0 2 4 6 8 10 12 37% Doba dohasínání 2 ns 37% z intenzity v čase 0 čas (ns) 0 0.001 0.01 0.01 0.1 1 log I(t) 5 6 Proč měřit dobu dohasínáníProč měřit dobu dohasínání fluorescencefluorescence ?? * Absolutní měření ­ doba dohasínání nezávisí na koncentraci vzorku * Doba dohasínání je závislá na okolním prostředí a může být použita k určení jeho polarity, pH, teploty, koncentrace iontů, přítomnosti zhášedla * Přidává další rozměr při fluorescenčním mapování ­ zvyšuje jeho selektivitu * Umožňuje měřit rotační korelační čas molekul ­ rotační pohyblivost 5 7 Hlavní způsoby měření časové závislosti fluorescence * Pulzní metoda (time-domain) zdrojem excitačního záření je krátký pulz * Metoda fázově modulovaného budícího záření (frequency domain) zdrojem excitačního záření je sinusově modulované světlo 5 8 Pulzní metoda * Vzorek je excitován krátkým pulzem s trváním mnohem kratším než doba dohasínání * Závislost intenzity fluorescence na čase (dohasínání) je použita pro výpočet doby dohasínání 5 9 Počítání fotonů: Time-Correlated Single Photon Counting TSCP time Při každém pulzu excitačního světla může být zaznamenán jeden emitovaný foton. Typické uspořádání je, že jeden foton připadá na 100 excitačních pulzů. Měří se čas mezi excitačním pulzem a zaznamenaným fotonem. Vytváří se histogram, který znázorňuje časovou distribuci fotonů Pro vyhodnocení křivky dohasínání je potřeba mít soubor alespoň 4000 fotonů 5 10 Časové značení fotonu (Time Tagged Time-Resolved ) * Zapisuje se nejen čas vyzáření fotonu po jednotlivém pulzu (start-stop-time; ps), ale také čas od začátku experimentu (real-time; ns) Podle firemní literatury PicoQuant http://www.picoquant.com/dl_notes/TechNote_TTTR.pdf 5 11 Zdroje pro TCSPC Laserové diody Ší5ka pulzu FWHM = 70 ps (plná šířka v polovině maxima) Rychlost opakování pulzu 40 MHz LED (Light Emitting Diode) FWHM = 1,4 ns (plná šířka v polovině maxima) Rychlost opakování pulzu 40 MHz 5 12 Rychlý detektor (MCP PMT) * Je nejdůležitější při sledování časové závislosti fluorescence * V současností jsou nejrychlejší mikrokanálové deskové fotonásobiče (MicroChannel Plate PhotoMultiplier Tube) * Mají rychlou odezvu, elektron putuje v detektoru méně než 1 ns. Ve srovnání s klasickým fotonásobičem je odezva 10 krát rychlejší. 5 13 Detektor - fotonásobič Light Detectors: Photomultiplier Tube (R928 Side-on) Boční okno 24 mm2 Fotokatoda Fokusační elektroda Násobiče elektronů (dynody) foton fotoelektron Anode Vakuum 10-4 Pa Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 5 14 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 TIME, CHANNELS PHOTONCOUNTS MCA S CFDSYNC IBH 5000U TAC rate 1MHzTAC rate 1MHz Coaxial Delay 50 NsCoaxial Delay 50 Ns Sync delay 20 nsSync delay 20 ns TBX-04 nanoLED 2% statistical single photon events periodic pulses Kumulativní histogram TACV Princip přístroje s TCSPC Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 5 15 Praktické určení t eII t = 0)( 37.00 1 0)( == IeII 5 16 1 10 100 1000 10000 100000 -10 -5 0 5 10 ČAS, KANÁLY početfotonů 1 10 100 1000 10000 100000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TIME, CHANNELS PHOTONCOUNTS -4 -3 -2 -1 0 dohasínání po pulzu Intenzita je funkcí času: I(t)= exp (-t/) Intenzita zdroje světla je také funkcíčasu L(t) Konvoluce fluorescence : F(t)= I(t) L(t) Složený signál dohasínání Princip skládání (konvoluce) signálů 5 17 Časově rozlišená fluorescence fluoresceinu IRF * Fluorescein ve vodě při pH 9.0 * Excitace 450 nm * Pulzní LED s opakovací frekvencí 20 MHz IRF Instrument Response Function signál zdroje a odezva přístroje IRF je křivka odpovídající nejkratšímu možnému času dohasínání, který lze na daném přístroji měřit 5 18 Více fluoroforů v systému: multiexponenciální dohasínání * poměrné zastoupení fluoroforu * doba dohasínání daného fluoroforu * Celková intenzita je dána součtem (konvolucí) příspěvků od každého fluoroforu * Při analýze je nutno použít dekonvoluce ­ rozklad signálu na příspěvky jednotlivých fluoroforů )/(exp ... )( 21)( 21 iit Nt tI eeeI N ttt -= ++= --- 5 19 Rozlišení skládání signálů dvou fluoroforů (dekonvoluce) * Při určování příspěvků od jednotlivých fluoroforů někdy není možno přesně určit a , protože ke stejnému proložení můžeme použít jejich různé kombinace * Různé dvojice a mohou dát velmi podobný tvar křivky dohasínání 5 20 Časově rozlišená fluorescence lidského sérového albuminu HSA Fluoroforem je tryptofan V proteinu je tryptofan jenom jeden, přesto je časová závislost dohasínání vícexponenciální. Je to dáno různými konformacemi proteinu v roztoku Tryptofan se nachází ve více různých lokálních prostředích Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 5 21 Metoda fázově modulovaného budícího záření 1. Vzorek je excitován sinusově modulovaným světlem s vysokým frekvenčním rozsahem srovnatelným s převrácenou hodnotou doby dohasínání 2. Když dojde k excitaci vzorku modulovaným zářením, emitované záření fluorescence odpovídá modulační frekvenci budícího absorbovaného záření 3. Emise je časově zpožděna ve srovnání s budícím zářením, což se projeví fázovým posunem. Fázový posun je použit k výpočtu doby dohasínání fluorescence 5 22 stupně/čas 0 2 (360°)/T Intenzita -2 -1 0 1 2 fázový posun Určení doby dohasínání metodou fázové modulace b a B A 4 (720°)/2T 6 (1080°)/3T Modulace excitace b/a (výška peaku/střední intenzita) Modulace emise B/A Relativní modulace m ab AB m / / = Určení času dohasínání z fázového posunu = tan 22 1 1 m m + = Určení času dohasínání z modulace m excitační záření emise fluorescence 5 23 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 TIME AMPLITUDE ( ) ( ) M = 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 10 100 1000 Frequency, MHz 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 M Princip měření pomocí fázové modulace ab AB m / / = % Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 5 24 Praktický příklad výpočtu = 68° = tan 22 1 1 m m + = m= 0.4 = tan -= 1 11 2 m m 5 25 Závislost parametrů získaných metodou fázové modulace na * Čím je kratší doba dohasínání , tím více se posunuje průnik křivek k vyšším frekvencím * Pro delší dobu dohasínání = 10 s je nutno použít modulační frekvence 10 kHz až 1 MHz * Pro kratší dobu dohasínání = 100 ps je nutno použít modulační frekvence až 2GHz tedy 10 000 krát větší 5 26 Časově rozlišená fluorescence fluoroforů v rozdílném prostředí * Flourofory mají ve stejném prostředí stejnou hodnotu * Po přidání zhášedla se sníží doba fluorescence u fluoroforu na povrchu 2 * Výsledkem je ,,prohnutá" křivka * Úkolem dekonvoluce je pak určit 1, 2 a poměrné příspěvky fluoroforů 1,2 * Protein se dvěma fluorofory - tryptofany 21 21)( tt eeI t -- += 5 27 Změna rotačního korelačního času při multimerizaci proteinu * Časové závislosti polarizované fluorescence lze použít při sledování změny dynamiky systému molekul * Sledování multimerizace fosfofruktokinázy 0 10 20 30 40 Čas (ns) logr(t) = 5 ns = 20 ns M T 5 28 Fluorescence LifeTime Imaging Microcsopy FLIM * Sledování časové závislosti fluorescence v 2D prostoru * Umožňuje rozlišit prostředí ve kterém se fluorofory nacházejí * Umožňuje sledovat zhášení flouroforů, ať už vlivem prostředí, zhášedla nebo interakce s jinými molekulami 5 29 Použití FLIM při sledování interakce proteinů H. Wallrabe and A. Periasamy, Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy, Current Opinion in Biotechnology, Volume 16, Issue 1, Analytical biotechnology, 2005, Pages 19-27. Rychlejší dohasínání v přítomnosti zhášejícího proteinu Normální dohasínání 5 30 Příklad detailního zobrazení FLIM Závislost doby dohasínání fluorescence NADH je dvouexponenciální s hodnotou 0.4 ns pro volnou a 3 ns pro navázanou molekulu NADH 5 31 Využití časově rozlišené fluorescence při proteomické analýze Gel barvený Sypro-Ruby Intenzita Časové rozlišení Intenzita je doplněna o pseudobarevné časové rozlišení, aby mohly být oba parametry zviditelněny současně Časové rozlišení fluorescence může pomoci při analýze proteinů v překrývajících se pásech Upraveno podle materiálů Materialů Photonic Research Systems Ltd. www.prsbio.com 5 32 Literatura * Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. * Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. Poděkování