2. Obecné principy diferenciace Diferenciace je vývojový proces, během kterého se mění morfologie a funkce buněk, přičemž až na malé výjimky typu přeskupování subgenů u B-lymfocytů, zůstává genetický materiál beze změn. Nespecializované (prekurzorové, progenitorové buňky) se tak mění na konečné specializované funkční typy. Diferenciace je podmíněna změnami genové exprese, které vedou ke změnám velikosti, tvaru, polarity, metabolické aktivity nebo citlivosti k různým signálům. Na začátku vývoje člověka nebo jakéhokoli mnohobuněčného organismu je jediná buňka - oplozené vajíčko (zygota), která se dělí a postupně rozrůzňuje podle přesných pravidel genetického programu. V dospělosti je lidské tělo složeno ze zhruba 1014 buněk a více než 200 různých buněčných typů. Diferenciace je přesně řízený proces, s dokonalým časováním i prostorovou závislostí. Podle schopnosti diferenciace do různých buněčných typů se rozlišuje několik typů prekurzorových buněk. Totipotentní prekurzorová buňka je schopná diferencovat do všech buněčných typů v organizmu). Pluripotetní buňky vznikají z totipotetních a dávají vznik všem třem zárodečným listům. Mohou tedy iniciovat vznik jak buněk endodermu, mezodermu i ektodermu. Multipotetní buňky mají již omezenou schopnost sebeobnovy i omezené spektrum buněčných typů, které z nich může vznikat, Multipotetní jsou např. některé specializované hematopoetické kmenové buňky. Unipotetní buňky dávají vznik jedinému buněčnému typu. Jako kmenová buňka, se označuje primární nediferencovaná buňka schopná sebeobnovy (tedy umožňuje vznik identické kopie sebe sama) a zároveň i diferenciace do pokročilejších stádií. Obr. 15. Diferenciace zygoty do zárodečných listů jednotlivých buněčných typů. Hematopoeze Typickým příkladem toho, jak fungují principy buněčné diferenciace je vznik imunitního systému a krvetvorba - hematopoeze. Všechny krevní buňky vznikají sériemi mnoha buněčných dělení z jediné hematopoetické kmenové buňky. Během diferenciace krevních buněk a tvorby imunitního systému se vytváří složitá informační síť řízená mezibuněčnými signály ­ zejména cytokiny nebo různými chemickými látkami. Obr. 16. Hematopoeze. Stručný přehled některých cytokinů, které se účastní krvetvorby Rodina Cytokin Receptor Produkující buňky Funkce Účinek vyřazení z funkce Epo (erytropoietin) EpoR Buňky ledvin, hepatocyty Stimuluje tvorbu erytrocytů Epo i EpoR: letální IL-2 (Růstový faktor T- buněk) CD25 (), CD122 (), CD132 (c) T lymfocyty Proliferace T-lymfocytů Deregulovaná proliferace a vývoj Tbuněk, autoimunitní poruchy IL-3 CD123, c T lymfocyty, epiteliální buňky thymu Řídí rané fáze hematopoeze Poruchy vývoje eozinofilů IL-4 (BCGF-1, BSF-1) CD124, CD132 (c) T lymfocyty, žírné buňky Aktivace B lymfocytů, tvorba IgE, regulace TH1 buněk Snížená syntéza IgE IL-5 (BCGF-2) CD125, c T lymfocyty, žírné buňky Tvorba a diferenciace eozinofilů Poruchy tvorby IgE a cytokinů Il-9 a IL-10, poruchy tvorby eozinofilů IL-6 (IFN-2, BSF-2, BCDF) CD126, CD130 T lymfocyty, makrofágy, endoteliální buňky Tvorba Ta B-lymfocytů, tvorba proteinů akutní fáze zánětů IL-6: poruchy produkce IgA IL-7 CD127, CD132 (c) Tzv. non- T-lymfocyty Tvorba preB- a preT- lymfocytů Poruchy tvorby preB- a preT - lymfocytů IL-9 IL-9R, CD132 (c) T lymfocyty Aktivace TH2 zprostředkovaná žírnými buňkami IL-11 IL-11R, CD130 Stromální fibroblasty Spolu s IL-3 a IL-4 regulace hematopoeze IL-13 (P600) IL-13R, CD132 (c) T lymfocyty Růst a diferenciace B-lymfocytů, inhibice tvorby prozánětlivých cytokinů makrofágy a TH1 buňkami G-CSF G-CSFR Fibroblasty a monocyty Stimuluje vývoj a diferenciaci neutrofilů Poruchy myelopoeze, neutropenie IL-15 (Růstový faktor T-buněk) IL-15R, CD122 (ILR) CD132 (c) Řada tzv. non- T-lymfocytů Podobný IL-2-like, stimuluje růst střevního epitelu, T- a NK buněk GM-CSF (granulocytemacrophage colonystimulating factor) CD116, c Makrofágy, T-lymfocyty Stimuluje růst a diferenciaci myelomonocytárních linií, zvláště dendritických buněk GM-CSF, GM-CSFR: Pulmonální alveolární proteinóza OSM (OM, onkostatin M) OSMR or LIFR, CD130 T-lymfocyty, makrofágy Stimuluje buňky Kaposiho sarkomu, inhibuje růst melanomu Hematopoetiny LIF (leukemia inhibitory factor) LIFR, CD130 Stroma kostní dřeně, fibroblasty Udržuje embryonální kmenové buňky, podobný IL-6, IL-11, OSM LIFR: smrt krátce po narození nebo in utero, nízké množství hematopoetických kmenových buněk IFN- CD119, IFNGR2 T-lymfocyty, NK Aktivace makrofágů, regulace MHC Snížená TH1 odpověď, vnímavost k bakteriálním a virovým infekcím IFN- CD118, IFNAR2 Leukocyty Protivirové, zvýšená exprese MHCI vnímavost k virovým infekcím Interferony IFN- CD118, IFNAR2 Fibroblasty Protivirové, zvýšená exprese MHCI B7.1 (CD80) CD28, CTLA-4 Antigen prezentující buňky Kostimulace T-lymfocytů CD28: snížená aktivita T-lymfocytů B7.2 (B70, CD86) CD28, CTLA-4 Antigen prezentující buňky Kostimulace T-lymfocytů B7.2: snížená odpověď na alloantigeny Imunoglobuliny CTLA-4: masivní lymfoproliferace, raná smrt TNF- (kachektin) p55, p75 CD120a, CD120b Makrofágy, NK, T-lymfocyty Lokální zánět, endoteliální aktivace TNF-R: odolnost k septickému šoku, vnímavost k infekci Listeria TNF- (lymfotoxin, LT, LT-) p55, p75 CD120a, CD120b T-lymfocyty, B-lymfocyty Endoteliální aktivace TNF-: chybí lymfatické uzliny, snížená tvorba protilátek, zvýšená tvorba IgM LT- LTR nebo HVEM T-lymfocyty, B-lymfocyty Vývoj lymfatických uzlin Chybný vývoj periiferních lymfatických uzlin, Peyerových plaků a sleziny CD40 ligand (CD40L) CD40 T-lymfocyty, Aktivace B- lymfocytů Slabá protilátková odpověď, Fas ligand (FasL) CD95 (Fas) T-lymfocyty Apoptóza, cytotoxicita nezávislá na Ca2+ Fas, FasL: mutantní formy vedou k lymfoproliferaci a autoimunitním poruchám CD27 ligand (CD27L) CD27 T-lymfocyty Stimuluje proliferaci T-lymfocytů CD30 ligand (CD30L) CD30 T-lymfocyty Stimuluje proliferaci T-a B-lymfocytů Zvětšený thymus, alloreaktivita 4-1BBL 4-1BB T-lymfocyty Kostimuluje T- a B-lymfocyty Trail DR4, DR5 DCR1, DCR2 a OPG T-lymfocyty, monocyty Apoptóza aktivovaných T- lymfocytů a nádorových buněk RodinaTNF OPG-L (RANK-L) RANK/OPG Osteoblasty, T-lymfocyty Stimuluje diferenciaci osteoklastů a resorpci kostní tkáně OPG-L: osteopetróza OPG: osteoporóza TGF- TGF-R Chondrocyty, monocyty, T-lymfocyty Inhibuje proliferaci, působí protizánětlivě, indukuje sekreci IgA TGF: letální záněty IL-1 CD121a (IL1RI) a CD121b (IL- 1RII) Makrofágy, epiteliální buňky Horečka, aktivace makrofágů a T-lymfocytů IL-1RI: snížená produkce IL-6 IL-1 CD121a (IL1RI) a CD121b (IL- 1RII) Makrofágy, epiteliální buňky Horečka, aktivace makrofágů a T-lymfocytů Nezařazené IL-1 RA CD121a Monocyty, makrofágy, neutrofily, hepatocyty Váže se na IL-1 receptor, ale neaktivuje jej. Přirozený antagonista funkce IL-1 IL-1RA: nízká hmotnost, vnímavost k septickému šoku (endotoxinům) IL-10 (cytokine synthesis inhibitor F) IL-10R, CRF2­4 (IL- 10R) T-lymfocyty, makrofágy, B-lymfocyty transformované EBV Inhibuje funkci makrofágů IL-10 nebo CRF2­4: snížený růst, anémie, chronická enterokolitida IL-12 (NK cell stimulatory factor) IL-12R1 IL-12R2 B-lymfocyty, makrofágy Aktivuje NK buňky, indukuje diferenciaci CD4 T-lymfocytů do TH1-podobných buněk IL-12: narušená produkce in IFNa funkce TH1 podobných buněk MIF T-lymfocyty, buňky hypofýzy Inhibuje migraci makrofágů, stimuluje jejich aktivaci. Indukuje rezistenci ke steroidům. Rezistence k septickému šoku. IL-16 CD4 T-lymfocyty, eosinofily Chemoatraktant pro CD4 T-lymfocyty, monocyty a eosinofily, antiapoptotický faktor pro T-lymfocyty stimulované IL-2IL-17 (mCTLA-8) CD4 paměťové buňky Indukuje syntézu cytokinů epitely, endotelem a fibrobalsty IL-18 (IGIF, interferon- inducing factor) IL-1Rrp (IL1R related protein) Aktivované makrofágy a Kupfferovy buňky Indukuje produkci IFN- T-lymfocyty a NK, aktivace TH1, imunitní odpověď zprostředkovaná TH2 Narušená aktivita NK a TH1 Modelové linie V Laboratoři buněčné diferenciace UEB PřF MU se využívá několik buněčných linií, jejichž diferenciaci lze indukovat různými chemickými látkami nebo cytokiny. Základním modelem je buněčná linie kuřecích monoblastů BM2, které jsou transformovány virem ptačí myeloblastózy. Zásadní genetickou změnou, kterou tyto buňky prodělaly a která způsobila jejich leukemický fenotyp, bylo začlenění onkogenního genu v-myb do genomu. Jeho buněčný homolog c-myb kóduje klíčový regulátor diferenciace makrofágů. Buňky BM2 tak exprimují velká množství genu v-myb, nedokončují diferenciaci a trvale zůstávají ve stádiu proliferačně aktivních monoblastů. Pomocí chemické látky tetradekanoylforbolacetátu (TPA) je možné překonat diferenciační blok a indukovat tak diferenci do funkčních makrofágů. Další látky, např. kyselina okadaová (OA, inhibitor proteinových fosfatáz) nebo trichostatin A (TSA, inhibitor histonových deacetyláz) také umožňují diferenciaci buněk BM2 do mono ­ nebo multinukleárních makrofágů. Obr. 17. Buněčná linie kuřecích monoblastů BM2. BM2 BM2 po indukci diferenciace OA BM2 po indukci diferenciace TSABM2 po indukci diferenciace TPA Další zajímavou linií imortalizovaných hematopoetických buněk jsou myší makrofágy RAW264.7, které byly odvozeny z ascitu tumoru myši infikované virem Abelsonovy myší leukémie. Buňky RAW sice neprodukují virové částice a chovají se jako nádorové s neomezeným proliferačním potenciálem, ale zároveň si podržely schopnost diferencovat do mnohojaderných makrofágů, osteoklastů i do dendritických buněk. Buňky RAW jsou senzitivní zejména k molekulám cytokinů M-CSF (Macrophage-Colony Stimulating Factor) a RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand), které indukují diferenciaci do obřích osteoklastů, buněk které jsou in vivo zodpovědné za resorpci kostní tkáně. Použitím samotného M-CSF získáme mnohojaderné makrofágy. Tyto buňky také citlivě reagují na přítomnost některých bakteriálních látek, např. lipopolysacharidu (LPS, endotoxin), tvorbou antigen prezentujících dendritických buněk. Obr. 18. Buněčná linie myších makrofágů RAW264.7.. RAW - kontrola RAW + M­CSF RAW +M­CSF + RANKL RAW + LPS Buněčná linie HL-60 patří mezi dnes už klasické modely nádorové molekulární a buněčné biologie, o čemž svědčí téměř 11000 dosud publikovaných prací zabývajících se HL-60 v databázi Pubmed. Linie HL-60 byla odvozena z nádorových buněk pacientky trpící akutní promyelocytární leukémií. Představuje významný systém umožňující studium fyziologie i nádorové transformace leukemických buněk na úrovni granulocytů, monocytů a makrofágů. Genom HL-60 obsahuje amplifikovaný protoonkogen c-myc, který patří k významným regulátorům buněčné diferenciace a proliferace. Narušení kontroly jeho exprese a funkce vede k nádorovému fenotypu. Uměle lze diferenciaci navodit působením např. DMSO, TPA nebo kyselinou retinovou. Obr. 19. Lidská promyelocytární linie HL-60 Buňky U937 byly izolovány z pleurálního výplachu pacienta trpícího generalizovaným histiocytárním lymfomem. U937 mají velké množství monocytárních znaků a využívají se jako in vitro systém diferenciace monocytů a makrofágů, resp. granulocytů a dalších buněčných typů. Diferenciace U937 může být navozena řadou látek, mj. forbolovými estery, kyselinou retinovou, TNF, vitamínem D3 nebo IFN. Obr. 20. Lidská linie U937. Funkční změny provázející diferenciaci některých hematopoetických buněk Cytocentrifugace Cytocentrifugace (Cytospin) umožňuje převedení buněk ze suspenze na mikroskopické sklíčko a vyhodnocení jejich morfologie, jejíž změny diferenciaci provázejí. Postup: 1. Stanovit koncentraci buněk na hemocytometru 2. Odebrat 5 × 104 buněk, centrifugovat 600g/5 min. 3. Resuspendovat pelet ve 100 l 1 × PBS 4. Sestavit cytocentrifugační komůrku a suspenzi centrifugovat 500g/4 min 5. Rozebrat aparaturu, sklíčka nechat krátce oschnout 6. Obarvit pomocí setu DiffQuick 7. Jemně opláchnout vodou, nechat uschnout, vyhodnotit Obr. 21. U buněk BM2 byla indukována diferenciace činidly TPA a TSA a následně provedena cytocentrifugace. Na mikrofotografiích v části ,,A" jsou cytocentrifugované, fixované a obarvené buňky, v části ,,B" jsou živé buňky rostoucí na misce. Jasně je vidět změna tvaru buněk i preference adheze před růstem v suspenzi. Imunofluorescenční mikroskopie Imunofluorescenční mikroskopie umožňuje detekci specifických antigenů pomocí protilátky s konjugovaným fluorescenčním barvivem. Specifita je dána právě protilátkou, konjugovaný fluorochrom umožňuje amplifikaci signálu a zviditelnění cílových antigenů na klasickém fluorescenčním nebo konfokálním mikroskopu. V praxi se využívá většinou systému dvou protilátek, tzv. primární, je specifická pro svůj jedinečný cíl, epitop antigenu, druhá, tzv. sekundární, která nese fluorochrom, se váže pouze na primární protilátky. Využití sekundárních protilátek je výhodné, protože můžeme mít pro několik různých primárních protilátek pouze jedinou označenou sekundární (která je pochopitelně dražší než neoznačená primární). Specifita sekundární protilátky je dána živočišným druhem, ve kterém byla vytvořena primární, např. myš (sekundární protilátka je označená jako anti-mouse), králík (anti-rabbit), koza (anti-goat), ale také třeba křeček (anti-hamster) nebo osel (anti-donkey). Imuofluorescenčním zviditelněním tak lze sledovat přítomnost specifických antigenů závislých na stupni diferenciace. BM2 BM2 + TPA BM2 + TSA Primární protilátka Sekundární protilátka konjugovaná s fluorochromem Obr. 22. Detekce jednoho z proteinů intermediálních filament ­ vimentinu v buňkách BM2 pomocí nepřímé imunofluorescence. Primární protilátka detekovala vimentin v různém množství v závislosti na stupni diferenciace buněk BM2. Sekundární protilátka konjugovaná s fluorochromem FITC potom zviditelnila místa s navázanou primární protilátkou ­ a tedy i lokalizaci vimentinu. Propidium jodidem červeně je označena DNA. Postup: 1. Kultivovat 0.3×106 buněk na 2ml miskách s krycím sklíčkem a indukčními činidly. 2. Pokud buňky adherují na povrch sklíčka, odsát médium a misku se sklíčkem promýt 2ml 1×PBS. Pokud buňky přisedlé nejsou, provést cytocentrifugaci na krycí sklíčko. 3. Fixace (aceton:metanol 1:1). 4. Pečlivě odsát fixační směs. 5. Opláchnout 3×5min v 1×PBS. 6. Blok v 5%mléku (není nutné) 7. Opláchnout v TBS 8. Sklíčko inkubovat s primární protilátkou (většinou 1:200) 2hod/RT 9. Opláchnout 3×5min v TBS 10. Nanést sekundární protilátku konjugovanou s FITC (1:100), inkubovat 1hod/RT 11. Opláchnout 1×5min v TBS 12. Opláchnout 1×5min v TBS + RNázou A (1:500) 13. Opláchnout 2×5min v TBS 14. Odsát TBS, přidat 400l propidium jodidu (50g/l), inkubovat 5 min. 15. Opláchnout 1×5min v TBS 16. Sklíčko osušit, umístit buňkami dolů s cca 4l montovacího média MOWIOL (Calbiochem) 17. Buňky pozorovat pod fluorescenčním mikroskopem Detekce přítomnosti specifických enzymů Diferenciace některých buněčných typů je provázena přítomností specifických proteinů s enzymovou aktivitou. Tyto enzymy jsou obvykle nezbytné pro správnou funkci diferencovaných buněk ­ příkladem může tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza (TRAP), která je ve velkém množství produkována zralými osteoklasty, které ji využívají jako jednu ze složek enzymového aparátu při degradaci kostní tkáně. Detekce TRAP se provádí na cytocentrifugovaných nebo jiným způsobem imobilizovaných buňkách tak, že permeabilizované buňky jsou inkubovány za vhodných podmínek v pufru obsahujícím substrát, který TRAP přeměňuje na barevný (červený) produkt. Jednoduchým vyhodnocením pod mikroskopem jsme tak schopni potvrdit přítomnost tohoto enzymu a stanovit tak příslušný buněčný typ. Postup (optimalizovaný protokol pro misky): (Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit, # 387A, Sigma Aldrich) 1. Připravit 5ml misky s diferencovanými osteoklasty. 2. Promýt 1×PBS. 3. Do misky napipetovat 3ml fixačního roztoku, fixovat 30sec. 4. Promýt sterilní deionizovanou vodou. 5. Inkubovat v pracovním roztoku bez přístupu světla 1hod/37°C 6. Promýt deionizovanou vodou 7. Případně podbarvit hematoxylinem, promýt deionizovanou vodou, vysušit. 8. Místa s aktivními kyselými fosfatázami, případně TRAP jsou zbarvena červeně. Obr. 23. Buňky RAW264,7 kultivované v přítomnosti M-CSF (vlevo) nebo M-CSF+RANKL (vpravo). Pouze u zralých osteoklastů (vpravo) produkují TRAP a akumulují červený pigment v cytoplazmě. Mnohojaderné makrofágy, které mohou osteoklasty připomínat, TRAP nevytvářejí. Roztoky: Fixační roztok: 20ml citrátového roztoku (#91-51) + 30ml acetonu Pracovní roztoky: 1. Připravit směs 0,5ml Fast Garnet GBC Base Solution (#387-2) a 0,5ml Sodium Nitrite Solution (#91-4). (Diazotace) Inkubovat 2 min/RT. 2. Připravit roztoky podle tabulky: Detekce všech kyselých fosfatáz Detekce TRAP Deionizovaná voda 37°C 45ml 45ml Diazotizovaný Fast Garnet GBC Solution (krok 1) 1,0ml 1,0ml Naphthol AS-Bl Phosphate Solution (#387-1) 0,5ml 0,5ml Acetate Solution (#386-3) 2,0ml 2,0ml Tartrate Solution (#387-3) - 1,0ml Fagocytóza Diferenciace některých krevních buněk je provázena získáním schopnosti fagocytózy. Samotný test je velmi jednoduchý, příslušným způsobem diferencované buňky jsou inkubovány v přítomnosti silikátových mikročástic (DynaBeads), které jsou buňkami pohlceny. Obr. 24. DynaBeads mohou být využity k řadě separačních metod k izolaci různých buněčných typů, DNA, RNA, proteinů apod. V jednoduché úpravě mohou sloužit právě k analýze fagocytózy. www.invitrogen.com Obr. 25. Nediferencované buňky BM2 (nahoře) a buňky BM2 u nichž byla indukována diferenciace do makrofágů pomocí TPA. Během diferenciace buňky získaly schopnost fagocytózy. BM2 BM2 po indukci diferenciace TPA Postup: 1. K buňkám přidat Dyna(Fago)-beads v poměru 1:5000, tedy 10l beads na 10ml misku 2. Sklizené buňky promýt v 1 × PBS 3. Do zkumavky s Histopaque přenést buněčnou suspenzi; vrstvy se nesmí promíchat. 4. Cfg na centrifuze s výkyvným rotorem (Heraeus, 400g/30min) 5. Odebrat buňky z rozhraní obou vrstev, promýt 10 ml 1 × PBS/EDTA 6. Resuspendovat pelet v malém množství PBS a připravíme preparát. 7. Ihned vyhodnotit minimálně 200 buněk NBT test (Nitroblue tetrazolium test) Pomocí tzv. NBT testu lze detekovat tzv. oxidativní vzplanutí (oxidative burst), kterým vznikají reaktivní kyslíkové radikály, podílející se na odbourávání fagocytovaných částic. Podstatou testu je přeměna bezbarvé látky (nitroblue tetrazolium, tetrazoliová modř) na tmavě modrý formazan. Vyhodnocení se provádí změřením absorbance v buněčném lyzátu, případně vizuálně v intaktních buňkách pod mikroskopem. Obr. 26. Nitroblue tetrazolium Obr. 27. Aktivované neutrofily (a) fagocytují a redukují molekuly NBT na tmavě modré krystaly formazanu. Pro kontrolu slouží neaktivované neutrofily (b). Pacienti trpící CGD (Chronic Granulomatous Disease), mají poškozený mechanismus ,,zážehu" oxidativního vzplanutí, nemohou likvidovat fagocytované bakterie a jejich NBT test je tedy negativní a ve výsledku podobný obrázku (b). Chapel H. et al. 2006. Essentials of clinical immunology. Blackwell Publishing. Postup: 1. 1 × 106 buněk cfg. 1500rpm/5min. 2. Odsát supernatant 3. K peletu přidat roztoky I a II 4. Rozsuspendovat buňky 5. Inkubovat 1 hod/37°C (inkubátor) 6. Přidat 200l 10% Tritonu , lehce roztřepat 7. Extrahovat 20-30 min./RT 8. Po skončení inkubace 200l na mikrotitrační destičku 9. změřit absorbanci na ELISA readeru při 620nm (reference) a 570nm (measurement) Roztoky: I: 1 × PBS II: 1mg/ml NBT v PBS + 8l/ml zásobního roztoku PMA (TPA 100M) 10% Triton X-100 v 100mM HCl