3. Nekróza a programovaná buněčná smrt Jako nekróza se označuje neřízená smrt buňky nebo tkáně, způsobená vnějším neočekávaným zásahem. Narozdíl od apoptózy jako formy programované buněčné smrti, nedochází k aktivaci specifických vnitrobuněčných signálních drah, které řídí rozpad buňky a nejsou produkovány signály, které navádí fagocyty z blízkého okolí k místu zániku buňky. Během neřízené buněčné smrti vlivem zranění, infekce, hypoxie nebo nádorového onemocnění dochází k rozpadu buňky - bortí se cytoplazmatická membrána a do okolí se uvolňuje obsah buňky. Zároveň se rozpadají lysozomy a další buněčné kompartmenty, což vede k uvolnění zejména lysozomálních enzymů a zahájení nekontrolovaného sledu enzymatických reakcí, které poškozují sousedící tkáně. V blízkém okolí se mobilizují imunitní buňky, což může vést k zánětu. Morfologicky lze rozlišit několik typů nekrózy v lidských tkáních - koagulační (vzniká v hypoxickém prostředí - např. infarkt myokardu nebo sleziny), kolikvační (spojená s rozpadem buňky a enzymatickým poškozením tkání -např. zápal plic), hemorrhagická (spojená s poruchou krevního zásobení vtkáni a prostoupením nekrotické tkáně krví), tuková (poškození tkání zejména účinkem uvolněných lipáz) a další, typické např. pro tuberkulózu (kaseózní nekróza). Nucleus NECROSIS APOPTOSIS Obr. 28. Srovnání nekrotické a apoptotické buňky. U nekrotické buňky je jasně patrná naprostá absence jakékoliv organizace nebo řízení procesu. Buňka se spontánně rozpadá. Buňka procházející apoptózou má naopak stále nepoškozenou cytoplazmatickou membránu a nedochází u ní tak k samovolnému uvolňování nebezpečného obsahu cytoplazmy nebo buněčných kompartmentů do okolí. Organ&llss Nemal cell SiriĚiibtebsioím; iho sliuctune ol liwj nucleus changaa. tjw biafcs ruse ant) become la'c=r;rD organeltes are located in the blat». ThSMlI membrane wptuw and releases tlie coirs coňiont; inc cmgenelles are not 'undGial. The itudaus begjns to break apafl, and ť» DNA oreaks into smaj] piůces. The organslres ana also kxaľed in lna Hubs. The Cell braaVs mto several apoplolic bodies; Uha organelles are slili f jncl :ina . Necrosis Apoptosis Obr. 29. Hlavní rozdíly v průběhu nekrózy a apoptózy. —> http://www.niaaa.nih.gov/Resources/GraphicsGallery/ Liver/changes. htm —> Alberts B., et al. 2000. Molecular Biology of the Cell, 4' edition, Garland Science Textboks, Taylor & Francis Group Programovaná buněčná smrt (PCD) Jestliže během nekrózy zaniká buňka nekontrolovane a představuje pro organismus patologický jev, je programovaná buněčná smrt nezbytným procesem doprovázejícím embryonální vývoj a je i součástí života dospělého organismu. Obr. 30. Jedna z možných variant programované buněčné smrti: Sousední buňka aktivuje v cílové buňce molekulární dráhy, které vedou k morfologickým změnám (smršťování cytoplazmatické membrány, kondenzace a fragmentace jaderné DNA, vznik apoptotických tělísek). Umírající buňka zároveň vysílá signály k fagocytům v blízkém okolí, které pohltí její pozůstatky bez patologické (zánětlivé) reakce a poškození sousedních tkání. —> http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Apoptose-german.png Programovaná buněčná smrt může být aktivována na základě vnitřních stimulů (např. neupravitelným poškozením DNA) nebo okolními buňkami - většinou solubilními cytokiny rodiny TNF. Oba dva způsoby vedou k aktivaci cysteinových proteáz - kaspáz, které celý proces zániku buňky provádí. Dvěma základními typy PCD jsou apoptóza, čili programovaná buněčná smrt v užším smyslu slova, a autofagie, což je vlastně způsob degradace proteinů, bakterií nebo jakéhokoli jiného materiálu obklopeného membránou uvnitř buňky, využitý pro odbourání buněčných organel. Oba způsoby se liší molekulárním mechanismem řízení i fyzického provedení zániku buňky. The barrier membrane-thai appears in the cell? Surrounds part of the cell? And creates a double-membraned aulophagcsome. Then, a lysosome with various hydrolytic enzymes approach^ and combines with ttie a ulophagosome? 11 becomes an autolysosoms. The hydrolytic enzymes break up the internal membrane, organelles, and protein of ttie aulophagosome. The ubiquitin-proteasome system The ubiquihn attaches to the unneeded proteins as a marker and the proteasome breaks them up. Obr. 31. Autofagie je vedle ubiquitin-dependentních mechanismů významným systémem pro degradaci pohlceného materiálu, bakterií nebo také vlastních proteinů. Za určitých okolností může buňka odbourat tímto způsobem i sama sebe. —> http://www.brh.co.jp/en/experience/journal/45/img/04_illl.gif Apoptóza Mechanismus iniciace apoptózy shrnuje následující obrázek: Deatfi llgand Apoptolic trigger I Ad a p tor molecule Endoplasmic reticulum stress. ■ Death receptor j-j ;ytcchrome c Apaf-1 ( *\ re—i J Procaspase-B Ca^pase-8 [inactive) tactive) PracaspasB-9 Caspgse-9 (inactive) (active) \ L^Procaspase-1 2 i \. (inactive) J Proca5pa&e-3 Caspase-3 (inactive) (active) > Caspase-12 (active) I n _^>- Apoptoais APP . Mehmet H.: Caspases find a new place to hide. 2000. Nature 403(6): 29-30. Obr. 31. (a), (b) a (c) označuji tři možné způsoby aktivace apoptózy. (a): dráha se aktivuje v případě neopravitelného poškození DNA nebo jiného vnitřního stimulu. Cytochrom c a další pro-apoptotické signální molekuly jsou uvolněny do cytosolu, kde se podílí na tvorbě komplexu spolu s Apaf-1 aprokaspázou 9. Výsledkem je aktivní kaspáza 9. (b): Aktivace a oligomerizace tzv. death-receptorů (např. Fas nebo TNF) vede k aktivaci prokaspázy 8 na její aktivní dimerní formu, (c): Pokud dojde k uvolnění velkého množství CaII+ např. poškozením endoplazmatického retikula dochází k aktivaci kaspázy 12. Všechny tři dráhy iniciačních kaspáz 8, 9 a 12 aktivují společný cíl, kterým je kaspáza 3. Kaspáza 3 štěpí ß-amyloid precursor protein na amyloid ß-peptide, který se zpětnou vazbou podílí na aktivaci dalších molekul kaspázy 3. Celá signální dráha probíhající od aktivace PCD po zánik buňky je ovšem mnohem složitější, zahrnuje systém pozitivních i negativních zpětných vazeb a je striktně regulovaná. Poškození jednotlivých komponent má klíčový význam v nádorové transformaci. H2A.X Cflfoniíde PI3 Kinose Apoptosis upstate now port of Millipore Analýza programované buněčné smrti Pro studium apoptózy a nekrózy lze využít řadu metod, které sledují např. morfologii buňky, stav degradace DNA, aktivitu kaspáz apod. Morfologie apoptotické buňky 1. Světelná mikroskopie y ú '': • .'+-.; Obr. 32. Kontrolní, neovlivněné buňky U937 U937 + Kamptotecin, 6 hodin Kamptotecin ovlivňuje aktivitu topoizomerázy I, čímž dochází ke vzniku jednořetězcových zlomů v DNA. Buňka na tato poškození reaguje iniciací apoptózy. Na výřezech jsou patrná apoptotická tělíska. U937 + Kamptotecin, 24 hodin Většina buněk v populaci již zahynula - tzv. buněčný debris, který je viditelný na tomto obrázku je výsledkem sekundární nekrózy -rozpadu apoptotických tělísek a mrtvých buněk (ty bývají in vivo odstraněny fagocyty) 2. Fluorescenční mikroskopie Během apoptózy dochází ke kondenzaci chromatinu a štěpení jaderné DNA. Jednou z možností, jak sledovat rozpad jader je jejich obarvení vhodným fluorescenčním barvivem, nejčastěji propidium jodidem (PI) a analýza fluorescenční mikroskopií. Obr. 33. Kontrolní buňky BM2 obarvené Pí. Jeden z derivátů buněčné linie BM2 (BM2cJUN), u kterého byla programovaná buněčná smrt. PCD byla vyvolána indukcí exprese transkripčního faktoru c-jun v prostředí s minimem sérových růstových faktorů. Postup: 1. Buněčnou suspenzi promýt v 1 x PBS, cfg. 1500 rpm/5 min. 2. Fixovat ve směsi methanolu (75%) a kyseliny octové (25%) min. lhod/-20°C. 3. Cfg. 2000 rpm/5 min. 4. Pelet resuspendovat v cca lOOul fixační směsi, v závislosti na hustotě buněk 5. Suspenzi kápnout na podložní sklíčko a nechat krátce zaschnout 6. Obarvit buňky lul propidium j odidu (20mg/ml) a okamžitě hodnotit min. 200 buněk/vzorek. Analýza buněčného cyklu - pík subGO Během apoptózy dochází k degradaci DNA, řada buněk v Gl fázi buněčného cyklu, které procházejí apoptózou, tedy bude obsahovat množství DNA, které neodpovídá ani diploidnímu obsahu. Stanovením množství DNA např. průtokovým cytometrem můžeme tento počet buněk určit - na histogramu se projeví jako tzv. subGO pík. Obr. 34. Kontrolní buňky BM2 rn Sub GO (apoptóza) □ G0/G1 D S D M Buňky BM2, u nichž byla indukována apoptóza. Postup: 1. Buněčnou suspenzi (cca 1x10) promýt minimálně dvěma objemy 1 xPBS 2. Cfg 1500rpm/5min. 3. Odsát PBS, buňky rozsuspendovat v 0,5ml 1 xPBS 4. Přidat 4ml 70% EtOH (4°C) 5. Fixovat. 24 hod./4°C 6. Cfg 1500rpm/5 min./4°C 7. Buňky rozsuspendovat v 4 ml 1 x PBS 8. Cfg 1500rpm/5 min./4°C 9. Buňky rozsuspendovat v 0,5ml Vindelova roztoku, barvit 30 min.-lhod./37°C. Do měření uchovávat na ledu. Vindelův roztok: lMTris(pH8.0) lml RNasa l-7mg Triton (ev. NP-40) lOOul NaCl 60 mg Propidum Jodid 5mg Deionizovaná voda do 100ml. (pouze pokud buňky nejsou fixovány v EtOH) Uchovávat při 4°C; Dlouhodobě alikvoty v -20°C Podle: Robinson J.P., Handbook of flowcytometry methods, Willey-Liss 1993. Lokalizace fosfatidylserinu Fosfatidylserin je klíčovou složkou buněčných membrán, který je za běžných okolností lokalizovaný na vnitřní straně cytoplazmatické membrány. Během raných fází apoptózy se mění jeho lokalizace - je transportován na vnější stranu membrány (externalizace), kde slouží jako tzv. „eat me" signál, který navádí fagocyty k apoptotické buňce. Pro jeho detekci se využívá fluorescenčně označeného proteinu - Annexin V, který se na fosfatidylserin váže. Využitím průtokové cytometrie tak můžeme určit podíl buněk, které exponují fosfatidylserin na vnější straně membrány. Během analýzy se zároveň stanovuje integrita membrány pomocí propidium jodidu, což umožňuje odlišit nekrotické a sekundárně nekrotické buňky. Levý horní kvadrant: Buňky s porušenou membránou, přijímající Pí, s nezměněnou lokalizací fosfatidylserinu - nekróza Levý dolní kvadrant: Buňky nepřijímající Pí, s nezměněnou lokalizací fosfatidylserinu - živé buňky Pravý horní kvadrant: Buňky s porušenou membránou, přijímající Pí, s fosfatidylserinem na vnější straně membrány -sekundární nekróza Pravý dolní kvadrant: Buňky nepřijímající Pí, s fosfatidylserinem na vnější straně membrány - apoptóza Annewn-V-Fluo Obr. 35. Analýzy buněčné smrti stanovením extrenalizovaného fosfytidylserinu. Postup: V tomto případě je nutné provést tzv. vitální barvení, které nepoškozuje živé buňky. 1. Buněčnou suspenzi centrifugovat 1500rpm/5min apromýt 1 x PBS. 2. Pelet dvakrát promýt pracovní roztokem. 3. Přidat FITC-konjugovanou protilátku proti Annexinu V (0.5 ul/vzorek) a propidium jodid (5 Ug/ml) v pracovním roztoku. 4. Inkubovat 15 min. bez přístupu světla. 5. Změřit na průtokovém cytometru. Pracovní roztok (pH 7.4): lOmMHEPES 140mM NaCl lOmM CaCl2 Detekce mitochondriálního membránového potenciálu Změny v permeabilitě mitochondriálních membrán jsou detekovatelné již vraných fázích apoptózy. Tento proces se označuje jako kolaps elektrochemického gradientu, který probíhá podél celé mitochondriální membrány a je měřitelný pomocí tzv. membránového potenciálu (YD). YD se detekuje pomocí fluorescenčního barviva JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-l,l',3,3'-tetraethyl-benzamidazolocarbocyanin Jodid) pomocí průtokové cytometrie nebo fluorometrie. JC1 Histogram ČČČP Treated Cells Control Cells i ..... Obr. 36. Ve stabilních mitochondriích fluoreskuj í monomery JC-1 červeně, při změně parametrů mitochondriální membrány dochází k vyloučení JC-1 a vzniku agregátů, které fluoreskuj í zeleně. Poměr zeleného signálu k červenému umožňuje kvantifikaci membránového potenciálu. —> http://meds.queensu.ca/qcri/flow/apoptosis.htm JGT - Weil l-Hif -■;iri'fii MtMli.l- PARP 116KDa protein PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) je reparační enzym, který je v průběhu zániku buňky apoptózou štěpený různými kaspázami. Vznikají dva fragmenty o velikost cca 25kDa a 85kDA. Jeho detekce se provádí westernovým blottingem, pomocí protilátek cílených na různé fragmenty PARP. PARP Specific Antibodies From Epitomics Clnivagp slil 4Aip21B PARP-1 (p2S) eBt*fMl-126*Da \ PARP-1 (p9£] CBtna7fl-iesKDa (ft Da) 150— 100-* 75 — 5Ů— 37- um PARP-1 FuP L*nH(b Cít*l0ra.1 118 *Dh |Kba) 15D— — 100— 75— 50— 37— 25— 15— Jurt st Celli: Normal Apoptotic Normal Aooptotic Ncimil Obr. 37. Imunoblotting a analýza PARP. —> http://www.epitomics.com/products/parpl_intro.html DNA Ladder V průběhu apoptózy je jaderná DNA štěpená na krátké fragmenty, které lze detekovat Ethidium bromidem a zobrazit na agarózovém gelu. Po elektroforéze tak vzniká typický vzor, označovaný jako „DNA ladder' (žebřík). 1 2 3 iH Obr. 38. Dráha č. 1 je lkb DNA standard, č. 2 genomová DNA z kontrolních buněk BM2, č.3 genomová DNA izolovaná z monoblastů BM2, u nichž byla indukována apoptóza. Podobnou metodou, která je schopná odhalit fragmenty DNA vznikající během apoptózy je tzv. „TUNEL" - (Terminal transferase dUTP nick end labeling). Metoda je založena na detekci „nicks" - zlomů v řetězci DNA, které mohou být identifikovány s využitím terminálni transferázy. Enzym terminálni transferáza (TdT) katalyzuje adici dUTP na volné 3' OH konce. Pokud jsou dUTP označené např. biotinem nebo fluoresceinem, můžeme sledovat aktivitu TdT. O n O n li HO-P-O-P-O-P-O- i i NH OH Obr. 39. dUTP, 2?-Deoxyuridin 5?-Trifosfát OD Q >- HL-BG CTfíL tYv:*2& - G2M M'I"M|IIIIIMI'|'IIII'I'HIIIIMMI DMA Content c 55 HL-6Q CAM 4h M""P'ipi'IIIM"pMMM'M|IMI»IH □NA Content Apoptotk Cells Obr. 40. Výsledek TUNEL assay —> http://www.compucyte.com Podobně jako TUNEL funguje i tzv. ISNTA (In situ nick translation assay), která detekuje zlomy v DNA pomocí DNA polymerázy. Využívá se zejména v tkáňových řezech.