4. Přenos DNA a genetické modifikace živočišných buněk
Izolovanou DNA lze do eukaryotických buněk přenést transfekcí, což je obdoba
bakteriální transformace. Existuje řada metod založených fyzikálních změnách struktury
buněčných membrán, chemických interakcích na lipidové bázi nebo využití fagocytárních
schopností některých buněčných typů, které lze pro transfekci použít.
Elektroporace
Elektroporace je fyzikální metoda, která umožňuje vnášet polární molekuly do
cílových buněk přes buněčnou membránu. Během přenosu, jsou buňky vystaveny krátkému
elektrickému pulsu, který naruší fosfolipidovou dvojvrstvu a umožní vstup nabitých molekul
do buňky.
Elektroporace buněk BM2
Postup:
1. Připravit 5 × 106
exponenciálně rostoucích buněk BM2, cfg 1500 rpm./5min.
2. Buněčný pelet rozsuspendovat v 400l média obsahujícího DMSO (1,25%). Přidat transfekční
DNA (10g DNA, rozpuštěné v Tris-Cl pH 7,5, na 400l média)
3. Transfekční směs převést do elektroporační kyvety a elektroporovat (U=260V, C=1050F,
R=2340, T=2430s)
4. Po elektroporaci přidat 400l média s DMSO a přenést buňky na 10ml misku
5. Inkubovat v 37°C/ON/10%CO2
6. Druhý den buňky promýt a dále inkubovat nebo zpracovat
Obr. 41. Schéma elektroporátoru:
Po zapojení prvního spínače (1) dojde k nabití
kondenzátoru, který se po zapojení spínače (2) vybíjí
a generuje pulz vysokého napětí. Jeho hodnota se
pohybuje mezi 10000-100000V/cm a trvá řádově
mikrosekundy až milisekundy. Tento pulz naruší
buněčnou membránu, vyvolá vznik pórů a změnu
membránového potenciálu o hodnotu 0,5­1V, což
umožní vnesení DNA ze suspenze do buňky na
podobném principu, na jakém je založena elektroforéza.
 http://opbs.okstate.edu/%7Emelcher/MG/MGW4/MG431.html.
Nukleofekce
Představuje modifikaci klasické elektroporace, která vnáší cizorodou DNA přímo do
buněčného jádra, což zvyšuje účinnost exprese exogenní DNA. Tato technologie vyžaduje
elektroporátor/nukleofektor, což je opět zařízení generující specifický elektrický pulz
v kombinaci s komerčními pufry, jejichž složení bylo optimalizováno pro jednotlivé buněčné
typy ( Martinet W. et al. 2003. Biotechnology Letters 25: 1025­1029)
Obr. 42. Nukleofektor (Amaxa)
Gene gun
Gene gun byl popsán v roce 1987 jako mechanická metoda umožňující
dopravit do buňky mikroprojektily obsahující DNA adsorbovanou na kovové (zlaté nebo
wolframové) částice. Metoda je využívaná zejména pro přípravu transgenních rostlin.
Obr. 43. Princip metody gene-gun.
Mikroinjekce
Roztok DNA je dopraven přímo do buněk pomocí mikromanipulátoru. Metoda
je využívaná jak pro přípravu transgenních buněk, zejména oocytů (a následně i celých
transgenních organismů), tak i pro klonování metodou nukleotransferu.
Obr. 44. Mikroinjekce oocytu.
Precipitace krystalů fosforečnanu vápenatého
Patří mezi rozšířené metody díky své nenáročnosti i přijatelným cenám jednotlivých
komponent. Nejprve se vytvoří ko-precipitát vnášené DNA a fosforečnanu vápenatého
pomocí DNA, chloridu vápenatého a fosforečnanového pufru, následně se přidá suspenze
krystalů k buňkám, které je pohlcují endocytózou nebo fagocytózou. Nevýhodou je možnost
degradace DNA ve vzniklém endozomu. Obdobným způsobem je DNA pohlcována při
použití DEAE dextranu, který tvoří s DNA pozitivně nabité komplexy.
Transfekce buněk QT6
Postup:
1. Den před transfekcí pasážovat buňky QT6 z konfluentní kultury na 5 ml misku
v poměru 1:10. Inkubovat přes noc v 37°C/10% CO2. Další den vyměnit médium.
2. Připravit trasnfekční směs obsahující max. 2g DNA, 25l 2,5M CaCl2 a vodu do
celkového objemu 250l. Přidat 250l roztoku 2×BES (50mM BES pH 6,95, 250mM NaCl,
1,5mM Na2PO4) a inkubovat 15 min/RT
3. Přikapat transfekční směs k buňkám a inkubovat přes noc/37°C/3% CO2
4. Odstranit precipitát dvojím promytím buněk, přidat 5ml média a inkubovat přes noc
v 10%CO2
Obr. 45. Tvorba
komplexů DNA
s Ca3(PO4)2
nebo DEAE.
 www.promega.com
Lipofekce
Metody založené na tvorbě umělých liposomů jako nosičů DNA nebo RNA mají řadu
výhod ­ jsou schopné přenášet různě velké molekuly DNA ­ od krátkých oligonukleotidů po
velké umělé kvasinkové chromosomy (YACs) nebo proteiny, mají relativně vysokou účinnost
u různých buněčných typů a umožňují tvorbu stabilních transfektantů. Jsou také použitelné
pro modifikace buněk in vivo a jsou tedy potenciálním nástrojem genové terapie.
Pro tvorbu liposomů se využívají lipidy nesoucí za fyziologického pH pozitivní náboj spolu
s neutrálními lipidy (obvykle L-dioleoyl fosfatidylletanolamin ­ DOPE). Lipid nesoucí
kationickou skupinu asociuje s negativně nabitou DNA za tvorby liposomálního komplexu,
který interaguje s buněčnou membránou. Liposomy jsou obvykle endocytovány. Neutrální
lipidy (DOPE) jsou tzv. fúzogenní a zajišťují fúzi liposomu s endosomem a uvolnění DNA
z lipidového komplexu
Obr. 46. Tvorba
liposomu.
 www.promega.com
Obr. 47. Struktura
obecného syntetického
lipidu s pozitivně nabitou
skupinou
Struktura DOPE
 www.promega.com
Lipofekce buněk BM2 ­ stabilní transfekce
Postup:
1. Připravit 5 × 106
exponenciálně rostoucích buněk BM2, cfg 1500 rpm./5min.
2. Promýt médiem OPTI-MEM, rozsuspendovat pelet v 1,5ml OPTI-MEM.obsahujícího 30l
lipofekčního činidla (např. Lipofectamin).
3. Přenést směs buněk na 5ml obsahujícího 1,5ml OPTI.-MEM s max. 15g transfekční
DNA.(vektor obsahující cDNA studovaného genu + vektor nesoucí rezistenci k G418)
4. Inkubovat 1 hod/37°C/10% CO2.
5. Zastavit reakci přidáním 3 ml média DMEM obsahujícího sérum (FCS/CHS) do výsledné
koncentrace 10%.
6. Třetí den kultivace přidat selekční činidlo ­ antibiotikum G418.
7. Rezistentní buňky se objeví během asi dvou týdnů selekce.
Infekce/transdukce
Do řadu buněk různých typů lze DNA úspěšně přenést i pomocí metod, založených na
infekci buněk některými viry. Ideální vektor splňuje následující předpoklady:
* Snadné získání vysokého titru (koncentrace) >108
částic/ml
* Jednoduchá a bezpečná manipulace
* Přesné a stabilní začlenění transgenu do virového genomu
* Funkční regulační oblasti transgenu
* Buněčná specifita
* Nevyvolává imunitní odpověď příjemce
Stručný přehled virových vektorů
Retroviry
Retroviry jsou charakteristické reverzní transkripcí virionové RNA a možností
začlenění vzniklé dsDNA do genomu hostitele. Vektory založené na retrovirech jsou
spolehlivé a efektivní a využitelné i pro přenos DNA in vivo. Nevýhodou jejich použití je to,
že DNA nesená většinou retrovirů (onkoretroviry) se začleňuje do genomu na náhodná místa
a navíc pouze v okamžiku buněčného dělení, tedy když není vytvořená jaderná membrána.
Druhou nevýhodu odstraňuje využití vektorů, založených na skupině retrovirů - lentivirech,
které aktivně pronikají jadernými póry a nejsou závislé na buněčném cyklu hostitelské buňky.
Příkladem lentiviru je např. lidský HIV, kočičí FIV nebo opičí SIV, způsobující těžké
imunodeficience.
Kategorizace retrovirů:
Retrovirus Rod Příklad
Jednoduché
1. Avian sarcoma and
leukosis
2. Mammalian B-type
3. Murine leukemia
5. D-type
Rous sarcoma virus (RSV)
Mouse mammary tumor virus (MMTV)
Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV)
Mason-Pfizer monkey virus (M-PMV)
Komplexní
4. Human T-cell
leukemia
Bovine leukemia
6. Lentivirus
7. Spumavirus
Human T-cell leukeima virus (HTLV)
Bovine leukemia virus (BLV)
HIV
Human foamy virus (HFV)
Obr. 48. Životní cyklus obecného retroviru a struktura jeho genomu.
Adenoviry
Adenoviry na rozdíl od většiny retrovirů jsou schopné infikovat i klidové, nedělící se
buňky. Virion se na povrchu buňky váže na receptor podobný integrinům a v komplexu s ním
je transportován do nitra buňky a posléze jadernými póry i do jádra. Adenovirová DNA se
většinou nezačleňuje do genomu hostitelské buňky a zůstává v tzv. epizomálním stavu.
Nevýhodou při použití in vivo je silná imunitní reakce příjemce
Obr. 49. Struktura adenoviru a jeho genomu.
 Dani S.U. 1999. The challenge of vector development
in gene therapy. Braz J Med Biol Res 32(2): 133-45.
+
Obr. 50. Struktura adenovirového genomu a jeho transkripce.
 Watson et al. 2003. Molecular Biology of the Gene. Addison Wesley, ISBN: 0321248643.
Adeno-asociované viry (AAV)
AAV jsou malá skupina virů (parvoviry), které v normálním životním cyklu vyžadují
současnou infekci tzv. helper virem, obvykle herpesvirem nebo adenovirem. Pokud ke
koinfekci nedojde, začleňuje se AAV do genomu hostitelské buňky, obvykle do velmi
specifického místa ­ v případě lidského AAVS1 do 19q13.3-qter. Následná infekce
adenovirem nebo herpesvirem může spící parvovirus aktivovat a umožnit produkci jeho
virionů. AAV vektory lze účinně přenést do dělících se i klidových buněk, včetně
mozkových, svalových nebo krevních CD34+ buněk.
Ostatní virové vektory
Herpesviry
HSV-1 způsobuje dlouhodobé latentní infekce senzorických neuronů a produktivní
infekce epiteliálních buněk. Schopnost herpesvirů přetrvávat v neuronech bez jejich
výraznějšího poškození dělá z této skupiny virů atraktivní kandidáty pro genetické modifikace
nervových buněk. Navíc mají kapacitu pro začlenění velkých úseků cizorodé DNA
a manipulace s nimi je poměrně jednoduchá.
Obr. 51. Struktura AAV a jeho genomu.
 Dani S.U. 1999. The challenge of vector development in gene
therapy. Braz J Med Biol Res 32(2): 133-45.
Virus vakcinie (neštovic)
Charakteristickým znakem těchto virů (rod Orthopoxvirus) je schopnost replikace
v cytoplazmě hostitelské buňky. Virus vakcinie je často využívaným expresním systémem
v savčích buňkách ­ mezi jeho výhody patří např. snadnou manipulace s virovými kulturami,
nezávislost na replikačním aparátu hostitelské buňky a účinná exprese nezávislá na transportu
a úpravě RNA.
Obr. 52. Struktura HSV-1 a jeho genomu.
 Taylor T. J. et al. 2002. Herpes simplex virus. Frontiers in Bioscience 7: d752-764.
Obr. 53. Životní cyklus viru
vakcinie.
 Moss B. 1991.Vaccinia Virus: A
Tool for Research and Vaccine
Development. Science 252: 1662-67.
Chimérické vektory
Protože žádný ze zmíněných virových vektorů není ideální, jsou snahy o vytvoření
hybridního systému, který ponese pouze žádané znaky. Příkladem může být adenoretrovirový
chimérický systém, složený ze dvou funkčních komponent AD-Rcis a AD-Rtrans.
AD-Rtrans je adenovirový vektor, kódující retrovirové funkce zodpovědné za tvorbu virionů
(Gag-Pol-Env) začleněné do E1 oblasti adenovirového genomu. AD-Rcis je také adenovirový
vektor nesoucí cis-regulační sekvence (LTR atd.) a transgenní expresní kazetu. Cílové buňky
transfekované oběma vektory přechodně produkují retrovirové vektory, které infikují
sousední buňky a indukují začlenění transgenu do genomu hostitelských buněk. Tyto vektory
jsou výhodné i pro použití in-vivo.
Shrnutí vybraných transfekčních metod
Metoda Výhoda Nevýhoda
Elektroporace
* Univerzální metoda pro modifikaci
většiny buněčných typů
* Relativně vysoká účinnost
* Malá nutná množství vnášené DNA
* Použitelná i in vivo
* Může dojít k poškození
buněk a snížení viability
* Může dojít
k nespecifickému přenosu
díky samotné podstatě
elektropermeabilty
Nukleofekce
* Vysoká účinnost i obtížně
transfekovatelných buněčných linií
nebo primárních buněk
* Jednoduchá metoda
* Rychlá exprese vnášených genů
* Vysoká cena přístroje i
komerčních kitů
Precipitace Ca2(PO4)3
* Levná a u některých buněčných typů
spolehlivá metoda
* Většinou nízká účinnost
* Nepoužitelná in-vivo
DEAE dextran
* Levná a u některých buněčných typů
spolehlivá metoda
* Nevhodná pro tvorbu
stabilních transfektantů,
omezená možnost
integrace DNA do
chromozomu
* Většinou nízká účinnost
* Nepoužitelná in-vivo
Lipofekce
* Vysoká účinnost
* Umožňuje transfekci většiny
buněčných typů i in vivo
* V některých případech
jsou lipofekční směsi pro
tkáňové kultury toxické
Mikroinjekce
* Vysoká účinnost ˇ Vysoká cena vybavení,
kvalifikovaný personál
Selekční markery
G418
Antibiotikum G418 je nejčastěji využívaným selekčním činidlem pro eukaryotické
buňky. Jedná se o aminoglykosilové antibiotikum podobné např. kanamycinu, neomycinu
nebo gentamycinu, které zasahuje do průběhu translace a blokuje proteosyntézu. Jeho účinek
ruší bakteriální enzym fosfotransferáza.
Hygromycin B
Antibiotikum blokující proteosyntézu prokyryotických i eukaryotických buněk. Jeho
účinek také ruší bakteriální fosfotransferáza.
Metotrexát
Chemická látka (dihydrofolát) inhibující enzym dihydrofolátreduktázu (DHFR),
enzym nutný pro syntézu purinů.
Obr. 54. Struktura G418.
Obr. 55. Struktura Hygromycinu B.
Obr. 56. Struktura metotrexátu .
Kyselina mykofenolová
Inhibuje enzym inosinátdehydrogenázu, katalyzující přeměnu inosinmonofosfátu
(IMP) na xantinmonofosfát (XMP) a narušuje tak syntézu guanosinmonofosátu (GMP).
Pokud je současně s aplikací kyseliny mykofenolové a xantinu exprimován bakteriální gen
pro xantin-guanosin fosforibosyltransferázu, je možné tento blok obejít. Účinnost selekce lze
zvýšit přidáním aminopterinu, který blokuje endogenní dráhu syntézy purinů.
Puromycin/stylomycin
Analog aminoacyl RNA blokující proteosyntézu. Rezistence k puromycinu lze
dosáhnout jeho acetylací (enzym puromycin ­ N-acetyl transferáza)
Tymidin kináza (TK)
Enzym TK katalyzuje alternativní přeměnu dTMP z tymidinu. Pokud je normální
přeměna dTMP z dCMP blokována např. aminopteriny, jsou buňky závislé na expresi právě
TK. Buňky deficientní pro TK mohou růst na médiu obsahujícím aminopteriny pouze tehdy,
byl-li jim dodána cizorodý gen kódující TK.
Obr. 57. Struktura mykofenolové kyseliny.
Obr. 58. Struktura puromycinu.
Obr. 59. Funkce tymidin kinázy v syntéze dTMP.
Promotory v expresních systémech
Inducibilní promotory
Umožňují řízenou expresi transgenu, obvykle v závislosti na přítomnosti nebo
nepřítomnosti látky, která je schopná s daným promotorem interagovat. Tyto látky musí
splňovat některé následující parametry:
* Absence pozadí - neměly by být přítomné v buňkách nebo organismu
* Nízká toxicita
* Specifita ­ měly by zasahovat do exprese pouze žádaného genu/promotoru
* Snadné odstranění ­ např. z živného média
* Lineární závislost mezi rychlostí transkripce z daného promotoru a množstvím induktoru
Příkladem mohou být promotory regulované alkoholem (alkohol-dehydrogenáza I),
tetracyklinem, steroidy nebo těžkými kovy.
Mezi konstitutivně aktivní promotory patří např. CMV (cytomegalovirový). Zajišťuje
stabilní expresi v nejrůznějších buněčných liniích nebo tkáních. Je často využíván např. pro
expresi sekvencí siRNA nebo cizorodých genů.
Cizorodý gen
Obr. 60. Struktura tzv. pMT promotoru,
využívaného v Laboratoři buněčné diferenciace.
Ionty těžkých kovů, např. zinku, aktivují expresi
vneseného genu (žlutě) z lidského
metalothioneinového promotoru IIA. Současně
s tímto genem je transkribován i gen kódující
povrchový antigen CD4, který usnadňuje selekci
buněk. Sekvence IRES včleněná mezi tyto geny
zajišťuje jejich nezávislou translaci.
 Smarda J., Lipsick J. S. 1993. Dicistronic selection for
nuclear proteins in living animal cells. Gene. 137(1):145-9.
Obr. 61. Vektor (Ambion)
využívající CMV promotor
pro expresi sekvence siRNA.
 http://www.ambion.com