Cytologie a morfologie bakterií "The role of the infinitely small in nature is infinitely large" Louis Pasteur SYLABUS PŘEDMĚTU • Mikroskopie Typy mikroskopů - optické a speciální optické mikroskopy - elektronová mikroskopie • Obrazová dokumentace a zpracování obrazu • Morfologie buněk a kolonií • Cytologie a struktura bakt. buňky • Růstové cykly bakteriálních buněk • Pohyb buněk, sporulace Buňka minimální jednotka strukturní, funkční a reprodukční • Vývoj buněčné teorie rozvoj mikroskopie (17. století až současnost) Jan Evangelista Purkyně (1787 –1869) mezi prvními na světě přisoudil buňkám jejich stěžejní význam pro život Matthias.J. Schleiden ( 1804-81) a Theodor Schwann (1810-82) 1839 buněčná teorie: Vývoj živé přírody se opírá o růst a tvoření buněk, buňky rostlin a živočichů se shodují tvarem a funkcí. Buňka je základní, stavební a funkční jednotkou živých organismů. Rudolf Virchow (1821-1902) „nové buňky vznikají jen dělením z již existujících“ Louis Pasteur (1822-1885) fermentace, popřel teorii spontánního tvoření buněk rozvoj biochemie (1.polovina 20.století) 1953 struktura DNA (Watson, Crick a Franklinová) Prokaryotická buňka • živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce • jádro neodděleno od CPL membránou, větš. kruhová (i lineární) DNA • haploidní buňky (1 alela) množící se nepohlavně • bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická • ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk – menší, volně v CPL vyjma Archea: 5S, 16S a 23S rRNA translace začíná N-formylmethioninem geny pro RNA bez intronů • specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky: peptidoglykan (až na mykoplasmata) steroly v membránách zcela výjimečně bičík – globulární bílkovina flagelin, pohyb rotací anaerobiosa, schopnost vázat N, tvorba kyseliny PHB (zásob.l.) pokud fotosyntéza - anoxigenní Velikost a tvary bakteriální buňky velký poměr povrchu k objemu – velká plocha kontaktu buňky s prostředím • Velikost bakt b. v µm Chlamydia 0,3 x 0,3 Bdellovibrio 0,8 x 0,3 Rickettsia 1 x 0,3 S. aureus 0,8-1 x 0,8-1 E. coli 2-3 x 0,4-0,6 B. subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1 Streptomyces vlákno x 0,7-1,6 Chromatium 25 x 10 Spirochety 500 • Tvary bakt. buňky Koky - sférické, oploštělé, lancetovité - diplo-, streptokoky, tetrády, sarciny, stafylokoky Tyčinky – rovné, zakřivené, větvící se, palisády pleomorfní Kokobacily Pupeny Prostéky Spirily Hvězdice Mycelia Morfologie kolonií Mikroskopie • Pojmy a schémata mikroskopie • A) Optická - zobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí viditelného světla 1) Varianty optického mikroskopu 2) Speciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně např. absorbcí UV i IR světla • B) Elektronová • C) Akustická Robert Hook 1665 Již olejová lampa Optická (světelná) mikroskopie Max. zvětšení 1500 X, max. rozlišení 200 nm Stavba světelného mikroskopu • - mechanické součásti - stativ, noha, tubus, revolverový měnič objektivů, stolek, makro- a mikrošroub • - optika mikroskopu (objektiv a okulár) – kombinace čoček, korekce vad • - osvětlovací zařízení - světlo prochází objektem - zdroj světla: lampa v noze s kolektorovou čočkou kondenzor – ze 2-3 spojených čoček - soustřeďuje světelné paprsky na objekt Základem mikroskopu jsou dvě soustavy čoček: 1) Objektiv – vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz pozorovaný okulárem jako lupou. Výsledkem je neskutečný, zvětšený a převrácený obraz. - čím kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím větší je zvětšení 2) Okulár – zvětšuje obraz vytvořený objektivem, zvětšení je prázdné. Koriguje zbytek vad. a) jeden – mikroskopy monokulární b) dva – binokulární (Carl Zeiss 1933), světelný svazek rozdělen hranolem na dva Na základě vlastností světla v prostředí vzniká obraz Pojmy mikroskopie Rozlišení - jak daleko musí být od sebe dva body, aby nesplynuly v jeden • Pracovní vzdálenost - povrch čočky objektivu --- krycí sklo • Kontrast - rozdíl ve vizualizaci objekt / pozadí Optické vady (aberace) objektivů: • Otvorová vada (kulová, sférická) Čočky objektivu nejsou tenké: různý lom paprsků od optické osy Bodový předmět zobrazen jako úsečka • Barevná vada (chromatická) Je způsobena optickou disperzí (závislost indexu lomu na vlnové délce světla). Bodový předmět zobrazován na různá místa optické osy v závislosti na vlnové délce světla. Okuláry – typy dle účelu mikroskopie • Huygensův - 2 čočky. Slabé achromáty • Ortoskopické – nezkreslují zorné pole, mají přesně stejné zvětšení v celém zorném poli. Zejména k měřicím účelům. Achromáty, planapochromáty • Kompenzační – kompenzují zbytkové chromatické vady. Apochromáty • Periplanatické – odstraňují astigmatickou vadu silněji zvětšujícich objektivů. Planapochromáty. • Brillovy – dioptrické • Širokoúhlé – průměr zorného pole až 2,5 cm • Projektivy - mikrofotografie Varianty optického mikroskopu • 1) Mikroskopie v temném poli – pro zvýšení kontrastu - preparát silný pro průchod paprsků - pozorování v odražených paprscích - upravený kondenzor osvětluje preparát zespodu (čočka uprostřed zacloněná) – objekt svítí • 2) Stereomikroskopie – 2 mikroskopy se samostatnými objektivy a okuláry - jejich optické osy svírají určitý úhel - plynulá změna zvětšení bez zaostření (operační mikroskopy) • 3) Mikroskopy pro mikrofotografování, pro pořizování videozáznamu s digitálními kamerami, projekční mikroskopy, mikroskopy s mikromanipulátory Speciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí např.UV, IR světla • fázově kontrastní mikroskop 1953 – Nobelova cena za objev – Frits Zernike (1888 – 1966) • interferenční mikroskop - diferenční interferenční kontrast dle Nomarského (DIC) • polarizační mikroskop • UV mikroskopie • fluorescenční mikroskop Fázový kontrast I. • Detaily objektů nejsou klas. světelným mikroskopem rozeznány vzhledem k malému kontrastu mezi strukturami s podobnou propustností světla možnost pozorování živých objektů v nativním stavu bez barvení • Různé části preparátu - různý index lomu – ohyb paprsků • Při průchodu světelné vlny objektem: zpozdí se, nemění intenzitu, ale posun její fáze - v závislosti na rozdílu indexu lomu dané struktury a okolí, na délce optické dráhy a na vlnové délce světla. Fázový kontrast II • Princip: V kondenzoru - kruhová clona (zatemnělý střed) Paprsky projdou vzorkem - na fázových objektech dojde k odchýlení některých paprsků z původního směru (vlivem ohybu, rozptylu, lomu). V objektivu - čtvrtfázová destička, také tvar mezikruží. Na ni dopad paprsků, co nezměnily směr při interakci s fázovými objekty, ty posunuty, ostatní paprsky (se změněným směrem) destičku minou, nejsou posunuty. Fázový kontras II. Obraz je vytvářen interferncí paprsků fázově posunutých i neposunutých • Pozitivní fázový kontrast: objekty tmavší vůči pozadí (fázově posunuty paprsky se změněným šířením) • Negativní fázový kontrast jsou-li objekty oproti pozadí relativně světlejší (fázově posunuty paprsky nevychýlené ze svého směru) Interferenční mikroskop • Princip: pracuje se 2 koherentními (interference schopnými) paprsky, 1. prochází objektem 2. vedle objektu Výhoda: možnost přímého měření indexu lomu objektů. • Princip: svazek polarizovaného světla je po průchodu preparátem štěpen polarizačním filtrem na 2 nepatrně posunuté svazky (nastává dvojlom). Takto se vytvoří i dva nepatrně posunuté obrazy, navzájem „kolmo polarizované“. Oblasti obrazů s fázovým posunem (způsobeného fázovými objekty preparátu) se přesně nekryjí a místa překryvu různého fáz.posunu jsou interferencí zviditelněna změnou jasu či barevným obrysem, v závislosti na použití monochromatického / polychromatického světla. Polarizační mikroskop • zviditelnění opticky aktivních nebo dvojlom vykazujících struktur • Princip: spojení konvenčního mikroskopu a polarimetru. • Optickou aktivitou se projevují i některé složky cytoplazmy i proudění cytoplazmy. UV mikroskopie • Princip: optika mikroskopu musí být z křemenného skla (dobře propouští UV). Obraz nepozorujeme okem, ale je zviditelněn na luminiscenčním stínítku a je fotografován. • Kratší vlnová délka UV = vyšší rozlišovací schopnost, té obvykle ale dosaženo není. Optika má korigovány vady pro jedinou vlnovou délku – takovou, co je přítomna ve zdroji UV záření. • Výhoda: přímé pozorování struktur propouštějících viditelné, ale pohlcujících UV světlo (bílkoviny, DNA). Fluorescenční mikroskop Využívá schopnosti některých látek po ozáření světlem o kratší vlnové délce emitovat viditelné světlo o delší vlnové délce. Využito dlouhovlnné UV a přilehlá oblast viditelného spektra emitovaného halogenovými lampami. UV světlu je přizpůsobena optika kondenzoru, zbytek optického systému totožný s běžným optickým mikroskopem. Přidány filtry (bariérový) chránící lidské oko před zbytkovým UV. Fluorescenci vykazují: někt. složky živé hmoty i bez obarvení (látky s aromatickým jádrem či heterocyklem – např. amk. tryptofan), většinu preparátů však barvíme fluorescenčními barvivy na zákl. specifické interakce s buněčnými strukturami. Mnohdy je fluorescenční barvivo (fluorochrom, fluorescenční sonda) navázáno na protilátku specifickou pro určitou bílkovinu v cytoplazmě, tak lze selektivně zviditelnit složky cytoskeletu eukaryotických buněk, chromatin, membr.bílkoviny apod. Schéma a princip fluorescenčního mikroskopu Optické mikroskopy vytvářející obraz postupně, z jednotlivých bodů (pixelů) = nesou informaci z úzkého světel.paprsku: 1.laserový řádkovací ( rastrovací, skenovací) konfokální mikroskop § Rušivé světlo z vrstev nad a pod rovinou ostrosti odstraněno z dráhy k detektoru zábranou s malým otvorem – výsledek: perfektně ostrý obraz. Paprsek se po objektu posouvá a obraz jednotlivých bodů se skládá v PC. Posunem paprsku do jiné hloubky lze vytvořit optické řezy a skládat je do 3D obrazu. § Význam: možnost pozorování i relativně silných preparátů, včetně nativních. § Konfokální mikroskop lze upravit i pro konfokální fluorescenční mikroskopii 2. barevný řádkovací mikroskop „s letící stopou“ § místo mechanického řádkovacího systému používá jasnou bílou světelnou stopu, která přebíhá po řádcích na obrazovce osciloskopu. § Výhody: výborné rozlišení, vysoký kontrast (úpravou jasu zdrojové světelné stopy v závislosti na absorbanci preparátu) 3. optická skenovací mikroskopie v blízkém poli NFOS § velmi úzký světelný paprsek prochází po řádcích velmi tenkým preparátem a jsou měřeny změny jeho intenzity. § Výhody: rozlišení 10 –100x vyšší než u klasického světelného mikroskopu. Výhodou oproti elektronové mikroskopii (viz dále) je, že vzorek nemusí být umístěn ve vakuu ale lze jej pozorovat např. ve vodném prostředí. Elektronová mikroskopie (EM) • Zobrazení předmětů pomocí urychlených elektronových svazků – elektrony mají vlnovou délku de Broglieových hmotnost.vln • Urychlením lze dosáhnout stotisíckrát kratších vlnových délek: Rozlišovací schopnost pak (σ= λ /n*sinα): velmi malá λ • Vlivem velkých optických vad použitých čoček (magnetické) poměrně malá numerická apertura – řádově setiny. Rozlišovací mez: desetiny nm (mlk) Transmisní elektronový mikroskop (TEM) • V biologické praxi: Z 5 000 - 100 000 × rozlišení: desetiny nm (větší molekuly) • Struktura objektu: průchodem el.svazku • Elektronový paprsek: ze žhaveného kovového vlákna • Proti rozptylu elektronů: v tubusu EM vysoké vakuum • Čočky vytvářeny obvykle rotačně symetrickým elmag. polem • Konečný obraz pozorujeme nepřímo, projekcí na luminiscenční stínítko Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM) • velmi úzký paprsek elektronů je vychylovacím systémem nucen přejíždět po povrchu preparátu po řádcích • Rozlišovací schopnost SEM o 1-2 řády menší než TEM, ale možnost pozorování objektů s komplikovanou 3D strukturou (signál totiž nese informaci o sklonu povrchu v místě dopadu svazku elektronů) výsledkem je obraz s vysokou hloubkou ostrosti Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) § Nad povrchem preparátu se pohybuje velmi tenký kovový hrot, ke kterému „tunelují“ elektrony z povrchu preparátu (tunelový efekt – jev kvantové mechaniky, kdy částice pronikají oblastí, na překonání níž by dle zákonů klasické mechaniky neměli dostatek energie) § Zobrazuje se elektronová hustota na povrchu preparátu s rozlišením na úrovni rozměrů atomů. § Výhody: Vzorky nemusí být ve vakuu, ale např. i ve vodném prostředí. Akustická mikroskopie • Hyperzvuk proniká v kapalinách i pevném prostředí do hloubky jednotek až desítek mikrometrů. • Pozorování preparátů neprostupných pro elektrony a viditelné světlo. • Informace o mechanických vlastnostech prostředí. Barvení buněk • Gramovo barvení – barvení bakterií jako identifikační metoda • Hans Christian Joachim Gram (1884) 1)Bazické barvivo --- 2)voda ---- 3)Lugolův fixační roztok --- 4)voda --- 5)aceton, ethanol --- 6)voda --- 7)safranin (dobarvení) Obrazová dokumentace a zpracování obrazu • Zařízení • Komprese a formáty obrazu • Pojmy • Programy - analýza obrazu (LUCIA) • www.micro-scope.de/toc.html • http://www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html • w3.uniroma1.it/MEDICFISIO/microscopy.htm • micro.magnet.fsu.edu/cells/bacteriacell.html