„Neesenciální struktury“ • Inkluze • Vrstvy vně buněčné stěny • Struktury pohybu • Fimbrie Inkluze • Zásobní látky • produkty metabolismu • uložené nepotřebné látky z vnějšku a prozatím bez funkce (kvasinky a stafylokoky hromadí vitamíny) • Bez membrány nebo s membránou ------ není biologická ----- není dvojvrstvou fosfolipidů. Je jednovrstevná: bílkovina+lipid bílkovina+polysacharid a) obdané membránou – 1 vrstva fosfolipidů (až na plyn.vakuoly) • Glykogen • PHB • Síra • Plynové vakuoly • Karboxizómy • Chlorobiové váčky Glykogen • membránový 160 – 300 nm, až 50% sušiny • počet 1-10 • rozpustný polymer glukózy • α-1,4-vazby a α-1,6 větvení na každém 8-10tém monomeru • Může a nemusí mít membránu • Ve světelném mikroskopu není viditelný: Barvení lugolovým roztokem Bakteriální glykogen je silně větvený. Slouží jako pohotová rezerva. PHB • kyselina polyhydroxymáselná • až 60% sušiny • viditelná ve světelném mikroskopu • Je to odpadní produkt metabolismu uhlíkatých látek • Vyskytuje se u aerobů: Bacillus, Pseudomonas Poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) in a Rhodospirillum species. PHB is one type of PHA. • PHB a glykogen jsou osmoticky a iontově neaktivní, vyskytují se v buňce při nadbytku zdrojů uhlíku a nedostatku zdrojů dusíku. Síra • zdroj energie pro chemolitotrofní sirné bakterie • zdroj elektronů v procesu fotosyntézy u fototrofních sirných bakterií – zelených a purpurových (tyto přijímají energii transformací slunečního záření) • amorfní Plynové vakuoly Cyanobacteria • plyny vznikají při metabolismu • množství plynu závisí na teplotě a viskozitě • nadlehčení buňky • buňka reguluje množství v závislosti na intenzitě metabolismu • membrána z jedné vrstvy bílkovin Karboxizómy • protáhlé cisterny • enzymy Calvinova cyklu • syntéza hexóz u autotrofů, chemolitotrofů a fotolitotrofů. • Za vhodných podmínek je vyšší počet • (1-10) • nedělí se Chlorobiové váčky • Jen zásobárny pigmentů – bakteriochlorofyl a karotenoidy • Nikoli reakce a vazba světla • Přenášeny do chromatoforů, kde vlastní fotosyntéza • Počet: 2-10 b) bez membrány Glykogenová granula – 20 – 100 nm, jedna buňka je může mít pouze s nebo bez membrány, v rámci rodu lze obojí zároveň. Polyfosfátová granula – volutin - při nadbytku ATP (možnost uložení velkého množství energie). Až 500 molekul, nerozpustný ve vodě. Nikdy není zdrojem energie, jen fosforu. Počet: 1 – mnoho, podle metabolismu. Vysoký počet je v době před přechodem do klidového stadia (známka sporulace). Krystaly – produkty metabolismu (oxalacetát) Parasporální inkluze = bílkovina vznikající při sporulaci. Je to zbytkový materiál nespotřebovaný při vzniku spor. Bioinsekticidy – Bacillus thuringiensis – na na moučné červy, i selektivní působení (až na druhy) Pigmenty • Produkty primárního i sekundárního metabolismu. Produkovány v závislosti na stanovišti. • Využívají se při metabolismu nebo mají protektivní účinek či jiný ekologický význam (inhibiční účinky). Pokud jsou produktem primárního metabolismu – jsou bezpodmínečné potřeby (bakteriochlorofyl, karotenoidy). • Protektivní účinek – absorbuje světlo o určité vlnové délce, jsou syntetizovány až v rámci sekundárního metabolismu. • Buňka může produkovat endo- (protektivní) i exopigmenty různých barev. • Řada pigmentů vzniká nadprodukcí látek. Př: kolonie Azotobactera na manitolové půdě po týdnu zčernají (zprostředka) – na základě nadprodukce tryptofanu • Lokalizace (podle své úlohy): v cytoplazmě, v CM u fototrofů, v periplazmatickém prostoru, (v buněčné stěně u kvasinek), jako exopigmenty – ekologický význam (inhibiční agens, ATB). Nejčastěji: karotenoidy – endopigmenty u většiny buněk • Bakteriochlorofyly a,b,c,d – anaerobní prostředí • Prodigiozin – extracelulární, mikrobicidní účinek – bakterie a plísně • Fenaziny– extracelulární, sek. metab., mikrobicidní účinek – bakterie a plísně (Erwinia) • Melaniny – hnědé, černé, tmavě červené. V závislosti na době kultivace. • Anthokyany – sek.metab., barva závisí na pH, u 5 druhů bakterií • Př: Micrococcus flavocianus – žlutý endopigment a fialový exopigment. Na MPA jen žlutý endop. Na glukozókvasničním agaru – oba pigmenty. Struktury vně buněčné stěny • ochrana před fagocytózou • před protilátkami • před vysycháním • před detergenty • vazba na povrch předmětů, tvorba biofilmu Pouzdro = kapsula • u téměř všech zástupců Enterobacteriaceae • zřetelně odděluje buňku • má antigenní vlastnosti, znemožňuje detekovat somatický antigen. Charakteristické pro virulentní kmeny. Míra virulence: formy S, M a R • působí proti fágům, protilátkám a fagocytóze, jako ochranná vrstva proti vlivům prostředí a proti první vlně imunitní odpovědi • je to vrstva dobře organizovaného materiálu, který nelze snadno odmýt z buněčného povrchu Jeden druh až 60 druhů kapsulových antigenů Tvorba pouzdra ovlivněna složením media, prostředím Mikrokapsula – do 0,2 nm • syntetizována stále • velikost není geneticky kódována • překrývá antigen buněčné stěny a má své vlastní antigenní vlastnosti • Složena z bílkovin, lipidů a polysacharidů • Není to bariéra proti průniku živin • Průkaz – ne mikroskopicky, pouze serologicky • Důkaz u vitální buňky: barvením tuku, terčíky v mikrokapsule + tukové kapénky v buňce. Makrokapsula • složena z polysacharidů, bílkovin nebo celulózy • minimálně dvakrát tlustší než buňka • Průkaz prostý: téměř jednotné složení – převažuje buď pouze bílkovina nebo pouze polysacharid. Lipidy jen do 1%. • Streptococcus – polysacharid • Bacillus anthracis – bílkovinná složka kyseliny poly-D-glutamové • Bacillus – k. glutamová • S-vrstva – jeden druh bílkoviny, druhově specifické, monovrstva. pravidelně organizovaná vrstva proteinů a glykoproteinů na povrchu bakt. buňky • Sliz – řídký, spojuje více buněk, snadno odstranitelný, difúzní neorganizovaný materiál, nejčastěji polysacharid. Může sloužit k pohybu. Ve vlhkém prostředí. Glykokalyx • netvoří se v laboratorních podmínkách za dostatku živin • = síťovina z vláken polysacharidů a glykoproteinů • umožňuje adherenci, která je málo (za pomoci kationtů, Př: zub) až vysoce (za pomoci lektinů, Př: uretra) specifická • Kationty umožňují spojení stejně nabitých buněk a povrchů, elektrostatické síly Pochvy Pouze mechanická funkce. • geneticky kódované • výhradně z polysacharidů • chemické složení a zbarvení druhově specifické • glukóza + kyselina glukuronová (Sphaerotilus) u jiných rodů např. fukóza • Někdy obsaženy hydroxidy kovů – v malém množství (zbarvení; Fe, Mn, Cu; závisí na druhu) • Př: Sphaerotilus, Leptothrix Sphaerotilus natans Vláknité útvary na povrchu buňky • bičík • pili • fimbrie • curli Bičík • supramolekulární komplex, několik řetězců bílkovin • globulární bílkovina flagelin (tvoří jej více jak 4 vlákna oproti fimbriím) • molekul.hmotnost flagelinu větší než pilinu • flagelární antigen, tvořen specif. bílkovinami, nemůže být zakryt kapsulárním ani somatickým antigenem • začíná v CM (oproti fimbriím, kt. jsou strukturou B.S.) Komponenty bičíku: • vždy bazální tělísko – u G- 4kruhy (2 v PG a 2 ve VM) G+ - 2 kruhy v CM • háček (hook) • vlastní vlákno (jen to antigenem) • Bazální tělísko zůstává po odstranění bičík. vlákna, to je do 20 až 30 min dosyntetizováno • G+ : zakotvení do CM a B.S.: bazální tělísko, 2 disky – jeden v CM, druhý v periplazmat. prostoru, B.S. kluzné ložisko-tam se otáčí osa, háček pro ohyb • G- : B.S. ne tak pevná, navíc vnější membrána, L pruh v peptidoglykanu buněčné stěny a P pruh ve vnější membráně • Průměr 13-20 nm. • Rychlost pohybu 1-100 μm/s za atraktantem. • délka bičíku několikanásobně větší než délka buňky • buňky lze snadno odstranit sklem (pipeta, tyčinka) Uspořádání: taxonomický znak 1) polárně – monotricha (Pseudomonas): pohyb dopředu: proti směru hodinových ručiček. Otáčení buňky: po směru hodinových ručiček. - amfitricha (Spirillum) - lofotricha (Spirillum) 2) po celém povrchu – peritricha (Proteus vulgaris, Agrobacterium). • Pohyb dopředu: shloučení bičíků a pohyb proti směru hodinových ručiček. Díky náboji se nezamotají. Rozpletení – kroucení buňky na místě. „Chce-li“ se buňka pohybovat jedním směrem, namotá bičíky, které jsou ve směru pohybu, na sebe a je tlačena bičíky druhé strany Pohyb buňky – odpověď na prostředí. • Intenzita odpovědi závisí na počtu bičíků, na teplotě a viskozitě prostředí. • primární pohyb je rotační, u eukaryot ATP donor E, u prokaryot gradient H+ iontů • rotace tedy vždy jedním směrem • více bičíku se díky stejnému náboji nezamotá, díky toku H+ se točí stejným směrem • vnější faktory ovlivňující pohyb: magnetické pole Země (zvl.struktury – magnetosomy (Aquaspirillum) od dvou do několika desítek, uvnitř či ve středu buňky, málo v blízkosti jádra) chemotaxe (odpověď na změny ve vnějším prostředí, funguje i při ↑ c živin, negativní chemotaxe od barviva, rychlost pohybu uměrná koncentraci barviva) fototaxe ( odpovědí na světlo je pohyb ↑ rychlosti než při chemotaxi) motility test medium, polotekuté Pohyblivý kmen roste i mimo inokulaci – v celém mediu • vnitřní faktory ovlivňující pohyb počet bičíků lokalizace bičíků na buněčném povrchu (nejpomaleji reagují peritrichia, efekt rychlý u vibrií, v = několik mikrometrů za sekundu) dostatek redukčních ekvivalentů Pozorování pohybu bičíku - důležitý dostatek kyslíku • v temném poli a intenzivním světle • Fixace – speciální batvicí metody pro světelný mikroskop, mořidlo tanin se obalí kolem bičíku, průměr se znásobí a zviditelní. Fázový kontrast • - v elektronové mikroskopii negativní barvení ootiskové preparáty po rychlém zmražení na -150 C Tvorba: • Samouspořádávání – molekuly flagelinu jsou středem vlákna transportovány na konec, vazba na konci bez enzymů, dosyntetizuje se vždy do stejné délky. Geny na stavbě: je jich asi 40, popsáno však jen 20. Př: HAP 1, 2, 3… Mechanismus chemotaxe E. coli • Regulace pomocí MCP systému Regulace: • po koncentračním gradientu živin – regulována délka přímého a otáčivého pohybu za atraktantem • rozeznává serin, aspartát, maltózu, ribózu, galaktózu a dipeptidy, 200ms • proteiny lokalizovány v sériích, nejčastěji na tyčkovitých koncích E.coli: MCP systém – methyl – accepting chemotaxis protein. • Protein je řízen methylačním procesem • Systém je vázán na CM • vnitřní část proteinu v cytoplazmě, vnější ční ven • Na vnitřní část proteinu (CheW) se váží enzymy cytosolu (proteiny ChE, ChA) • na vnější se váže atraktant • Protein ChA - schopen autofosforylace v případě, že na MCP není navázán atraktant • Po vazbě atraktantu předává protein ChA fosfátovou skupinu proteinu CheB (methylesteráza) • CheB enzym: demethylace MCP systému • Protein CheB předává fosfátovou skupinu proteinu CheY – pohybuje se k bičíku, reakce s proteiny na jeho základn, následuje vrtivý pohyb bičíku (otáčení). Během 10s fosfát odstraněn pomocí CheZ • Autofosforylace CheA bez atraktantu • Jinak předání fosfátové skupiny a demethylace • MCP+atraktant je dobrým substrátem pro protein CheR, což je methyltransferáza • Cytoplazmatická část má 4-5 methylačních míst – se zbytky kyseliny glutamové – ty jsou methylovány S-adenosylmethioninem • methyluje tento komplex, navázaných 4 až 5 methylových skupin poté nestimuluje CheA k autofosforylaci = pohyb bičíku • Odstraňování methylů - CheB • Žádný pohyb nesmí trvat dlouho, pro správnou reakci musí buňka reagovat na aktuální podnět – krátkodobá paměť receptorů • Pomocné látky pohybu – slizy, surfaktanty • Bez atraktantu – rovnovážný stav mezi CheA a CheY – střídání vrtivého a přímočarého pohybu • aerotaxe PILI - fimbrie • slouží k přenosu DNA konjugací, k přichycení fágů, různě velké, typicky u G- • struktura B.S • křehké, lámavé, různé morfologické typy –mnoho druhů • duté, vždy nepohyblivá trubička • jen G-, několik set • stavba: • 3, 4 nebo 5 vláken stočených do spirály • pilin - rodově i druhově specifický, lineární sekvence proteinových podjednotek • rozměry: • kratší než bičík, nejdelší je maximum podélné osy buňky, O/2-8 nm, délka 0,1 – několik nm, 3-5 molekul • na celém povrchu či jen na určité části buňky • Hemaglutinace • inhibována manosou (MSHA) • neovlivněna (MRHA) • fce : • uchycení k povrchům (adheze k nenabitým povrchům: G- drží lépe na podložním sklíčku lehkou jemnou vazbou) • kontakt bakteriofága • twitching motility I. • kódované chromozomálně-specifická adherence • specifická kolonizace u symbiontů, parazitů a patogenů (koregulace s tvorbou toxinu u Vibrio cholerae O1, E.coli – uropatogenní P pilus, adherentnce fimbrie + enterotoxin E. coli –obojí kódováno plazmidem) II. • sex fimbrie - kódované konjugativním plazmidem u donora DNA – 1ks, můstek pro plazmid (F pilus u E.coli, konjugativní plazmidy salmonel) barvení : kys.fosfowolframová zachová podobu f., kys. osmičelová – f. ztlustí a zkrátí • http://parts2.mit.edu/wiki/index.php/PROJECT_PROPOSAL • http://www.webcom.com/alexey/moviepage.html • www.bact.wisc.edu/.../structure.html • www.arn.org/mm/mm_movies.htm - animace, pohyb bičíku • www.focosi.immunesig.org/physibacteria.html • www.sedin.org/mol_museum.html