Protokol č.3 Barvení struktur buňky Inkluze Zásobní látky nebo produkty metabolismu nebo uložení nepotřebné látky z vnějšku a prozatím bez funkce (kvasinky a stafylokoky hromadí vitamíny). Bez membrány nebo s membránou - není biologická – není to dvojvrstva fosfolipidů. Je jednovrstevná, tvořená bílkovinou + lipidem nebo bílkovinou + polysacharidem. Mikroorganismy: Saccharomyces cerevisiae B. cereus CCM 2010 B. megaterium CCM 2007 Volutin – barvení polychromatickou methylenovou modří : Polyfosfátová granula – volutin - komplex při nadbytku ATP. Až 500 molekul, nerozpustný ve vodě, vazba vyžaduje ATP. Nikdy není zdrojem energie, jen fosforu. Počet: 1 – mnoho, podle metabolismu. Vysoký počet je v době před přechodem do klidového stadia (známka sporulace), splečně s glykogenem se objevuje ve starších buňkách. Postup: - nátěr buněk se usuší na vzduch - převrstvení polychromatickou methylenovou modří (= Löfflerova vyzrálá alespoň 12 měsíců) na 1-3 min - opláchneme a osušíme Pozorování pod imerzí: purpurová volutinová zrna a lehce namodralá cytoplazma V roce 1904 inkluze volutinu poprvé pozoroval MEYER u druhu Spirillum volutans. O složení volutinových inkluzí se dlouho nic nevědělo. V roce 1959 je WIDRA považoval za polyfosfáty v kombinaci s ribonukleovou kyselinou a lipoproteiny, až v roce 1963 MARTINEZ pomocí frakcionované centrifugace a chemické analýzy určil, že se jedná o poly-β-hydroxymáselnou kyselinu. Tuk – barvení Sudanem III. (0,1% roztok Sudanu III v ethanolu a glycerolu): V buňce se vyskytuje buďto rozptýlený ve vakuolách nebo zabudovaný v membránách. Shromažďuje se v přítomnosti kyslíku. V buňce běžně 2-3%. Tyto intracelulární inkluze se vyskytují zejména u kvasinek a mikromycet. Nejčastěji se k jejich barvení používá sudan III. (0,1 g sudanu III. se rozpustí ve směsi 50 ml glycerolu a 50 ml 100 % ethanolu, který musí být bezvodý), z něhož se kapka smíchá s kapkou suspenze s mikroorganismy a přikryje se krycím sklíčkem. Do 20 – 30 minut se volutin zbarví do růžovo červena (barvivo se rozpustí v tuku). Postup: - smíchání buněk s barvivem - působení 10-30 minut - překrytí krycím sklíčkem Pozorování: cihlově červené kapičky tuku Buněčná stěna – barvení Chanceovou metodou: - nátěr na sklíčko - fixace - převrstvení 1% krystalovou violetí, působení 2 minuty, oplach vodou, osušit - převrstvení 2% kongo červení, 30 – 60s, osušit Glykogen: - 160 – 300 nm, rozpustný polymer glukózy s α-1,4-vazbami a α-1,6 větvením na každém 8-10tém monomeru. Může tvořit až 50% sušiny. Ve světelném mikroskopu není viditelný. Může a nemusí mít membránu. Barvení lugolovým roztokem. Počet: 1-10. Bakteriální glykogen je silně větvený. Slouží jako pohotová rezerva. Barvení nativního preparátu - vedle krycího sklíčka nativního preparátu kápneme Lugolův rpztok - pozorujeme bezprostředně hnědá granula glykogenu Lugolův roztok - roztok KJ a jódu ve vodě; přidáním chloralhydrátu dostaneme Melzerovo činidlo. Lugolovo činidlo (též Lugolův jódový roztok) je činidlo skládjící se z 1 % jódu a 2 % jodidu draselného (KI) v destilované vodě. Jodid draselný je přidáván pro zlepšení rozpustnosti jódu ve vodě. Činidlo bylo poprvé připraveno francouzským fyzikem J. G. A. Lugolem v roce 1829. Lugolovo činidlo je používáno jako povrchové antiseptikum a dezinfekce. Lugolovo činidlo se používá taky jako indikátor přítomnosti organických látek, zejména škrobů - v jejich přítomnosti mění barvu do modrofialové až černé. Barvicích schopností činidla je využíváno v Gramově barvení a dalších technikách úpravy preparátů. amyloidní reakce - modrání stěn orgánů obsahujících škrob v látkách obsahujících jód (Melzerovo činidlo)