Protokol č.5 Acidorezistentní barvení Acidorezistentní bakterie špatně přijímají barvivo. Barvení se proto provádí za horka koncentrovanými barvivy. Již jednou obarvené buněčné stěny si barvivo podržují i po odbarvování kyselinami a alkoholem. Acidorezistenci vykazují zástupci rodů Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, v menší míře Corynebacterium. Jejich buněčná stěna obsahuje lipidické látky, především mykolové kyseliny. Ty brání průniku barviv a tak se velmi špatně barví Gramovým barvením. Buněčné stěny acidorezistentních bakterií se neodbarvují kyselým alkoholem (1.stupeň acidorezistence) a 1% HCl (2.stupeň acidorezistence) po obarvení Ziehl-Neelsenovým karbolfuchsinem. Mikroorganismy: Mycobacterium phlei CCM 5639 – 1. stupeň - rychle rostoucí mykobakteria. Tráva (Phleum), seno. medium č.24 - 22-52°C - krátké tyčky, 1-2 um, acidorezistence 2 stupně u mladých kultur (3-4denní), více než 5ti denní acidorezistentní v rozmezí 5 – 100%. - drsné kolonie s intenzivním žlutým až oranžovým pigmentem po 2-5ti dnech - mladé kultury acidorezistentní, po 5 – 7 dnech kultivace může být barvitelnost nestabilní 2. stupeň acidorezistence: Nocardia carnea CCM 2756 Rhodococcus erythropolis CCM 277 Corynebacterium glutamicum CCM 2428 +--------------------------------------------------------------------------------------------+ |Mycobacterium |Nocardia |Rhodococcus |Corynebacterium | |-----------------------+---------------------+-------------------------+--------------------| |Rovné nebo mírně |Mycelium |Slabé mycelium, |Nepravidelné tyčinky| |zakřivené tyčky, | | | | | |Starší kultury: |Fragmentujíví |Často svírají úhel | |0,2-0,6 x 1-10 μm|fragmentace |v nepravidelné tyčky a | | | | |koky |Nebo tvoří palisády | |zřídka větvená |Vláken v tyčinky a | | | | |koky |Netvoří vzdušné mycelium | | |vlákna, netvoří vzdušné| | | | | |Obvykle tvoří vzdušné| | | |mycelium | | | | | |mycelium | | | |-----------------------+---------------------+-------------------------+--------------------| |Rychlost růstu: |1-5 dní |1-3 dny |1–2 dny | | | | | | |2-40 dní | | | | |-----------------------+---------------------+-------------------------+--------------------| |Acidorezistence |Acidorezistence |Acidorezistence 2.stupně |Acidorezistence | |1.stupně |2.stupně | |2.stupně | | | | | | |Nemusí být 2.stupeň | | | | |-----------------------+---------------------+-------------------------+--------------------| |Špatně barvitelné |Barvitelné Gramem |Barvitelné Gramem |Barvitelné Gramem | | | | | | |Gramovým barvením, | | | | | | | | | |Pokud ano, tak G+ | | | | |-----------------------+---------------------+-------------------------+--------------------| |Penicilin rezistentní |Penicilin rezistentní|Penicilin sezitivní |Penicilin sezitivní | | | | | | |(některé druhy mohou | | | | | | | | | |být sezitivní, | | | | | | | | | |Př:M. avium) | | | | +--------------------------------------------------------------------------------------------+ Pomůcky: Ziehl-Neelsenův karbolfuchsin, kyselý alkohol (96% alkoholu se 3% HCl), Löfflerův roztok methylenové modři (před použitím zředěný 1:10), 1% HCl – pro důkaz druhého stupně acidorezistence Postup Ziehl-Neelsenova barvení: 1)Příprava plamenem fixovaného preparátu 2) Převrstvit koncentrovaným karbolfuchsinem 3) Zahřát do výstupu par, pak 3 – 5 minut – nesmí vařit 4) Oplach kyselým alkoholem (dvakrát max. 15s) 5) Dobarvit Löfflerovou methylenovou modří – 30s 6) Oplach vodou Jiný postup: Postup Kenyounovo barvení – modifikace acidorezistentního barvení: Jedná se o modifikaci acidorezistentního barvení a používá se u částečně až slabě acidorezistentních bakterií. Ty jsou alkoholem odbarvovány, nikoliv však slabými kyselinami. Kyselý alkohol je zde nahrazen 1% kyselinou chlorovodíkovou. v Pro informaci: Fluorescenční barvení - detekce a diagnostika mykobakterií http://webak.upce.cz/~kbbv/Student/Vyuka/Obecna_klinicka_mikrobiologie/Laboratorni_cviceni/Navody/Mikroskopicke_preparaty.pdf http://www.sci.muni.cz/mikrob/cytologie Mycobacterium Rovné nebo mírně zakřivené tyčky, zřídka větvená vlákna, 0,2-0,6 x 1-10 μm Netvoří vzdušné mycelium Nepohyblivé. Aerobní, ačkoliv Obligátní paraziti a saprofyti, optimum růstu je 30 – 45°C. Vysoký obsah buněčných a cytoplazmatických lipidů, s vosky obsahujícími v chloroformu rozpustné mykolové kyseliny s dlouhým větveným řetězcem (60-90C): rezistence vůči barvivům, vysychání, antibiotikům, fagocytóze Buněčná stěna – peptidoglykolipid ( obsah meso-DAP, Ala, Glu, glukózamin, kyselinu muramová, arabinóza, galaktóza Kolonie s oranžovým či žlutým pigmentem, zřídka růžovým (karotenoidy). Kolonie drsné, květákovité. Löwestein-Jenssenova půda. Někdy hladké – z klinického materiálu. G+C = 62-70 mol%. cord-faktor – glykolipid trehalóza 6,6 – dimykolát ve stěně mykobakterií, významný patogenní faktor, inhibice polymorfonukleárů, funkční poškození oxidativní fosforylace Nápadný je velmi pomalý růst s dlouhou generační dobou u většiny z nich. Rod mykobakterií obsahuje několik desítek druhů, z nichž některé jsou významnými patogeny v lidské medicíně. Nepatogenní, popř. podmíněně patogenní druhy se vyskytují ve vodě, v půdě, některá u zvířat. Mykobakterie jsou intracelulárními parazity vyvolávajícími chronickou infekci s tvorbou granulomů. V obraně má význam její buněčná imunita. K diagnostice se používá přímý mikroskopický průkaz (Ziehlovo-Neelsenovo barvení, fluorescenční mikroskopie), kultivace na spec. půdách, pokus na zvířeti (morčeti), metody molekulární biologie (PCR) Etiologie tuberkulózy + v roce 1882 Robert Koch objevil tuberkulózní bacil (Kochův bacil), dnes označovaný jako Mycobacterium tuberculosis + patří do rodu Mycobacterium, čeledi Mycobacteriaceae a řádu Aktinomycetales + v klasifikaci mikroorganismů jsou mykobakteria řazena na rozhraní mezi vyššími organismy, houbami a plísněmi a pravými bakteriemi (název je odvozen od řeckých slov mykes – plísně a bacterion – tyčka) Rozeznáváme mykobakteria klasická, vyvolávající tuberkulózní onemocnění, a netuberkulózní mykobakteria, vyvolávající mykobakteriózy (M. kansasii, M. avium). Ke klasickým mykobakteriím řadíme: + Mycobacterium tuberculosis – patogenní pro člověka, + Mycobacterium africanum – vyskytuje se převážně v tropické Africe, v Evropě zcela výjimečně, patogenní pro člověka, + Mycobacterium bovis – patogenní pro skot i pro člověka + základní vlastností mykobakterií je acidorezistence a alkoholrezistence – příčinou je vysoký obsah tukových látek v těle mykobakterií + tvarově jsou rovné nebo lehce zahnuté, granulované tyčinky, s oblými konci o délce 1 – 4 μm. Mohou být izolovaná nebo podélně uspořádaná ve shlucích. + kritická teplota, při které dochází k denaturaci mykobakteriálních proteinů a mykobakteria hynou, je 60-oC + chlad, a to i teploty blížící se absolutní nule, bakterie nepoškozují, ve zmrzlém stavu vydrží i léta