Protokol 6 Pohyb buňky Úvod: Pohyb je odpovědí na: gradient chemické látky, teplotu, světlo, gravitaci, kyslíkový gradient. Schopnost pohybu a jeho rychlost závisí na přítomnosti bičíků, počtu bičíků, lokalizaci bičíků (peritricha reagují nejpomaleji), viskozitě prostředí, gradientu koncentrace atraktantů a inhibičních látek, na paměti buňky (žádný pohyb nesmí trvat dlouho, pro správnou reakci musí buňka reagovat na aktuální podnět – krátkodobá paměť receptorů) . Rozmezí rychlosti: 1-100 μm/s. Bičík - G+ G- globulární bílkovina flagelin - začíná v cytoplazmatické membráně - proti eukaryotním bičíkům: jiná stavba, jiné bílkoviny, pohyb není vlnění, donorem energie není ATP ale proud H^+ - stavba: bazální tělísko (G- 4 kruhy, G+ 2kruhy), háček, vlákno - vlákno je flagelárním antigenem, specifické bílkoviny - tvorba samouspořádáváním - bičíky snadno odstranitelné skleněnou tyčinkou - primární pohyb je rotační; hnací síla: protonmotivní síla (proud H^+) (Vibrio Na^+) - při pohybu se bičíky nezamotají díky náboji - pohyb dopředu: proti směru hodinových ručiček, buňku tlačí před sebou - rozmotání bičíků: točení na místě - chemotaxe: regulace MCP systémem – po vazbě atraktantu chemické modifikace proteinů membrány: de- a fosforylace a demethylace - umístění bičíku: Vibrio cholerae Salmonella typhimurium Chi Aizawa, Teikyo University. Točivá síla je generována mezi statorem spojeným s rigidní konstrukcí buněčné stěny (k peptidoglykanu) a rotorem spojeným s flagelárním vláknem. Proteiny MotA a MotB tvoří složky statoru; FliF, G, M, a N (MS a C kruhy) jsou složkami rotoru. FlgB, C, F, a G jsou hnací hřídelí (drive shaft). FlgH a I (L a P kruhy) jsou objímkami, které vedou hřídel vnější vrstvou buněčné stěny. Rotor: 6-17 tis.otáček/min Vlákno: 200-1 000 ot/min Nerotuje konst.rychle Průměrná rychlost: 20-90μm/s 60x délka buňky/s Gepard: 25x délka těla/s David DeRosier, Brandeis University Typy pohybu: taxe – pozitivní a negativní; chemotaxe, fototaxe, aerotaxe, magnetotaxe Chemotaxe: Pohyb bez atraktantu – střídání přímého a otáčivého, vrtivého. Náhodný. Pohyb s atraktantem – nižší frekvence otáčení na místě Bakterie disponuje pamětí na okamžitou koncentraci atraktantu: porovnává prostředí s předchozí koncentrací – ve směru zvyšující se koncentrace se snižuje frekvence otáčení na místě. § Pozitivní (pohyb k atraktantu) a negativní – pozorování na Petriho misce § Koncentrační gradient § Chemoreceptory – v periplazmě nebo na cytoplazmatické membráně § Atraktanty: O/ cukry (odpověď už na 10^-8 M koncentraci), aminokyseliny; O/ 20 chemoreceptorů § Repelenty O/ bakt.odpadní produkty, inhibiční agens, barviva, chemické látky O/ 10 chemoreceptorů Závislost na prostředí: MCP systém čeledi Enterobacteriaceae je urč.způsobem vyvinut u druhů žijících v prostředí bohatém na živiny, liší se tedy od systémů recepce např.u oceánských bakterií: Vibrio furnissii – živí se chitinem, vykazuje, silná odpověď na nízké koncentrace oligosacharidů chitinu, nikoli na silné atraktans např.pro enterobakterie (aspartát). Fotosyntetické Chromatium – přitahováno H[2]S (donor elektronů), což je repelent pro většinu bakterií. H. halobium přitahováno leucinem, což je repelent pro enterobakterie. Rhodopseudomonas putida – chemoatraktantem jsou repelenty enterobakterií (benzoát) MCP systém není ovlivňen růstovým cyklem buňky, , není zahrnut v údržbě buňky, ale při zvýšené intenzitě růstu. – pohyb hraje roli při kompetici limitujících zdrojů. Chemotaxe hraje roli u adherovaných buněk Caulobacter – volné plovoucí buňky – není syntéza DNA, ani dělení, ale exprese MCP – podobných receptorů – silná chemotaxe. Pohyb za signály, dokud nenarazí na povrch bohatý na substrát – osídlení a iniciace buněčného dělení. Aerotaxe: Jedna z nejdříve popsaných taxí. (1883, Engelmann). Fototaxe: Fotokineze je snížení či zvýšení rychlosti odpovědi na změny intenzity světla. Pozitivní fototaxe ve směru nižší intenzity světla. Sinice – velikost buňky umožňuje vnímat směr světla. Bakterie – fotofobní. Akumulace ve stinném prostředí. Salmonella typhimurium, Chi Aizawa, Teikyo University Náplň cvičení: - porovnat pohyb buněk Microccocus luteus (pouze Brownův pohyb) s ostatními - příprava nativního preparátu – Nomarského kontrast - mikroskopie obarvených preparátů – fázový kontrast Mikroorganismy: Bacillus cereus CCM 2010 P. fluorescens CCM 2115T Proteus vulgaris CCM 1799 E. coli CCM 3954 Sphaerotilus natans CCM 2349 Micrococcus luteus CCM 169 – pro srovnání nativního preparátu POZOROVÁNÍ BIČÍKů Pozorování pohybu bičíku - 1) nativní preparát - kapka suspenze buněk v mediu na podložní sklo, nepřekrývat krycí, pozorování objektivem 20, nezanořovat!! Nomarského kontrast. Pro vitalitu buněk je důležitý dostatek kyslíku (citlivější buňky se hýbou jen nahoře). Je nutno opatrně proostřovat na horní část kapky – dostatek O[2]. Barvení bičíků: Závisí na způsobu kultivace. Kultivace buněk vhodná v tekutém mediu. Staré buňky odhazují bičíky. Fixace, speciální barvicí metody pro světelný mikroskop. Barvička obsahuje mořidlo tanin, které se obalí kolem bičíku, jeho průměr se znásobí a zviditelní. Postup: a) opatrně připravíme nativní preparát na odmaštěné podložní sklíčko b) opatrně překryjeme krycím sklem c) vedle krycího sklíčka kapka barvičky d) prosajeme filtračním papírem e) pozorování pod imerzí Barvička na barvení bičíků: roztok I (10 dílů) a II (1díl), zamražený Roztok I: 10ml 5% vod.roztoku fenolu, 2g taninu, 10ml Kal (SO[4])[2] . 12 H[2]O Roztok II: nasycený roztok krystalové violeti (12g) v ethanolu (10ml, 96%) (Pozn: Elektronová mikroskopie - negativní barvení, otiskové preparáty po rychlém zmražení na -150 °C) Agar na testování pohybu: Obsahuje nízké množství agaru – je to polotekuté medium (nižší viskozita prostředí). Na polotekutý agar se očkuje vždy jen do středu misky, aby se rozrůstala 1 kolonie. Nejlépe kličkou, trošku zanořit do agaru. Pohyblivé kultury udělají rozrůstající se kruh, někdy vlnící se. Nepohyblivé rostou jen v místě vpichu do určité velikosti. Výsledky za 3-5 dní. Složení do 100ml deminerailzované vody: yeast extract (0,1g), K[2] HPO [3] (0,01g), agar (0,2g). S miskou se nesmí hýbat. Nonmotile Bacillus anthracis is on the right. Growth is a single line of growth that does not deviate from the original inoculum stab. Note the diffuse cloud of motility in the positive control on the left. Motile Bacillus species with diffuse growth throughout the tube is on left. Textové pole: Proteus mirabilis •Solidní střed •Povlak •Konsolidovaná zóna •Terasy motility test medium, polotekuté Pohyblivý kmen roste i mimo inokulaci – v celém mediu Dynamika růstu kolonie: Periodicita migrace •Diferenciace plazivých buněk •Lag perioda předcházející migraci •Migrace plazivých buněk Regulace diferenciace Dediferenciace Impuls pevná půda, viskozita prostředí •Konsolidace mechanická zábrana rotace bičíků chemotaxe – glutamin Následek předání signálu inhibice dělení vlákna až 80 mm hyperprodukce flagelinu: 5000 až 10000 bičíků Způsob šíření 1.Posuvem z konsolidovaného okraje kolonie, kde jsou buňky již diferencovány a lem je organizován 2.Volným putováním z populace vegetativních buněk, kde začíná diferenciace Cyklus diferenciace Bees a kol. (2000): The interaction of thin-film, bacterial swarming and cell differentiation in colonies of Serratia liquefaciens. J. Math. Biol., 40: 27-63 Bees a kol. (2002): Quantitative effects of medium Hardness and Nutrient Availability on the swarming motility of Serratia liquefaciens. Bulletin of mathematical Biology. 64: 565-587 Chemotaxis This diagram shows some of the components required for chemotaxis toward the amino acid aspartate. Information flows from the outside of the cell (shown at the top) by way of porins, the periplasmic space, and the cytoplasmic membrane, to the inside of the cell (shown at the bottom), and then to the flagellar motors (not shown). Dashed arrows indicate physical displacement of chemicals by diffusion. Solid arrows indicate chemical modifications of proteins—phosphorylation or methylation. The cytoplasmic components, all Che proteins (CheW, CheA, CheR, CheB, CheY, CheZ), are identified by their fourth letter only. The receptor complex consists of two molecules of Tar, two of W, and two of A, with Tar spanning the cytoplasmic membrane. Chemoreception is depicted in orange, signaling in green (for “go”), adaptation in red (for “stop”). Tar is a protein required for taxis toward aspartate and away from certain repellents. ATP is adenosine triphosphate, the phosphate donor. SAM is S-adenosylmethionine, the methyl donor. The other chemicals shown are ADP, adenosine diphosphate; SAH, S-adenosylhomocysteine; CH[3], the methyl group; CH[3]OH, methanol; and P, inorganic phosphate. www.maths.gla.ac.uk/~mab/papersub.html www.nysaes.cornell.edu/pp/faculty/hoch/movies/ www.rowland.harvard.edu/labs/bacteria/index.html http://www.rowland.harvard.edu/labs/bacteria/projects_filament.html http://www.aip.org/pt/jan00/berg.htm www.medmicro.wisc.edu/.../research/index.html www.buddycom.com/bacteria/gnr/gnrgluox.html