Doplňky A. Bakteriální cytoskelet Bakteriální buňka obsahuje řadu vláknitých proteinů nutných pro - regulaci tvaru buňky - buněčné dělení a - segregaci chromozomů - rozdělování plazmidů - buněčné polaritě Jsou analogické všem třem cytoskeletárním strukturám eukaryotní buňky, a to nejen svou - 3D strukturou, ale i - biochemickými vlastnostmi. Nedávné technologické pokroky osvětlily vazby mezi buněčným dělením a segregací chromozomů. (Yu-Ling Shih and Lawrence Rothfield (2006): The Bacterial Cytoskeleton.Microbiology and Molecular Biology Reviews, p. 729-754, Vol. 70, No. 3; Michie KA, Löwe J. (2006): Dynamic filaments of the bacterial cytoskeleton. Annu Rev Biochem.;75:467-92). Bakteriální cytoskeletární proteiny se samouspořádávají ve vláknité struktury in vitro a tvoří organizované vláknité struktury in vivo. 1. Původ bakteriálního aktinového cytoskeletu Je dokázáno, že v bakteriálních buňkách funguje analog tubulinu, jmenovitě FtsZ (filamentous-temperature sensitive protein Z). Pomocí imunofluorescence byl rovněž u druhu Bacillus subtilis objeven analog aktinu - protein MreB. Formuje spirálovité struktury pod cytoplazmatickou membránou (L.J.F. Jones, R. Carballido-Lopez and J. Errington, Cell, 104, 913-922 (2001)). Studie distribuce MreB genů v říši Bacteria ukazují, že nesférické buňky vlastní jeden nebo více těchto genů. Buňky Bacillus subtilis bez tohoto genu ztrácí svůj tvar. Zbývá pochopit, zda MreB formuje vlákna. Purifikovaný protein MreB z buněk Thermotoga maritima je scopen in vitro formovat polymery podobně jako eukaryotní aktin (F. van den Ent, L.A. Amos and J. Löwe, Nature, 413, 39-44 (2001)). Pohled na polymery pod elektronovým mikroskopem ukázal, že se skládají z páru filamentů – každý byl vlákno protomeru. Podobnost mezi MreB a a aktinem byla zkoumána na krystalické struktuře proteinu MreB buněk T. maritima pomocí MAD (multiple anomalous dispersion). Strukturálně jsou si tedy podobné, i svou orientací. Trigonální krystaly MreB (P3[1]21, a = b = 51.58 AA, c = 292.37 AA) formují dvě shodné podjednotky, stejně jako u aktinu. Kombinací rentgenového záření a elektronové mikroskopie se došlo k závěru, že polymerované podjednotky aktinu a MreB formují shodná protofilamneta. Existuje však markantní rozdíl mezi polymery MreB a F-aktinem. Eukaryotní aktin je tvořen dvěma protofilamenty jemně propletenými do helikálního vlákna, zatímco bakteriální „aktin“ sestává z páru rovných protofilament (F. van den Ent, L.A. Amos a J. Löwe (2007): Bacterial Origin of the Actin Cytoskeleton. MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge (UK) http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Publications/Highlights/2001/life-sciences/LS10.html) Obr: Srovnání protofilamnet F-aktinu a proteinu MreB. Jsou znázorněny tři podjednotky obou polymerů, každá ze čtyř domén různé barvy. Podélné uspořádání je podobné: Dalšími podrobně studovanými proteiny s vlastnostmi aktinu jsou ParM (E. coli) a MamK (Magnetospirillum magneticum) a crescentin – podobnost intermediánním filamentům (Caulobacter crescentus). crescentin Obrázky: (Yu-Ling Shih and Lawrence Rothfield (2006): The Bacterial Cytoskeleton.Microbiology and Molecular Biology Reviews, p. 729-754, Vol. 70, No. 3). http://mmbr.asm.org/cgi/content/full/70/3/729?view=long&pmid=16959967 2. Caulobacter crescentus proteiny homologické tubulinu www.yale.edu/jacobswagner/research.htm: v Strukturální analog aktinu (MreB) - předurčení tvaru buněk C. crescentus, Escherichia coli, Bacillus subtilis. Koordinuje buněčnou morfogenezi, ve spojení s MreC (proteinem obalujícím buňku uvnitř periplazmatického prostoru. v V buňkách Caulobacter crescentus, je protein MreC spojen s penicilin vázajícím proteiny (PBPs), které katalyzují inzerci intracelulárně syntetizovaných prekurzorů do buněčné stěny. Protein MreC je podstatný pro prostorovou organizaci složek holoenzymů v periplazmě syntetizujících peptidoglykan (MreB řídí řídí lokalizaci prekurzorů peptidoglykanu v cytosolu). v Fluorescenční značení vankomycinem (Van-FL) také dokazuje, že cytoskeletární proteiny MreB a FtsZ, stejně jako MreC a RodA působí při syntéze PG. Je dokázáno, že proteiny MreB a FtsZ jsou vyžadovány pro morfogenezi polární stélky. FtsZ (filamentous-temperature sensitive protein Z) je vyžadován pro start časné syntézy peptidoglykanu vedoucí k tvorbě mezivrstev, zatímco MreB je nutný pro prodlužování stélky. Bakteriální cytoskelet a proteiny určující tvar buněčné stěny jako MreC spolupracují při lokalizaci komplexů koordinovaně syntetizujících buněčnou stěnu. (Arun V. Divakaruni, Cyril Baida, Courtney L. White and James W. Gober (2007): The cell shape proteins MreB and MreC control cell morphogenesis by positioning cell wall synthetic complexes. Molecular Microbiology, Volume 66, Issue 1, Page 174-188, doi: 10.1111/j.1365-2958.2007.05910.x) v Protein buněčného dělení: FtsZ (filamentous-temperature sensitive protein Z), je homologem tubulinu (bakterie tedy vlastní struktury vláknitého cytoskeletu). U caulobactera hraje roli i v prodlužování buňky – reguluje prostorové umístění enzymu MurG produkujícího lipid II (prekurzor peptidoglykanu). v Časné umístění FtsZ do kruhové struktury během prodlužování buňky je následováno převedením MurG a přesměrování syntézy prekurzorů peptidoglykanu do středu buňky. Děje se tak před buněčnou konstrikcí s přispěním k elongaci buňky. Za nepřítomnosti FtsZ se enzym MurG neakumuluje uprostřed buňky a buněčná elongace pokračuje inzercí peptidoglykanu i po okrajích buněčné stěny. Buňka tedy k elongaci využívá systém syntézy buněčné stěny závislý i neávislý na FtsZ; důležitost jednoho nebo druhého režimu závisí na načasování uspořádání FtsZ během elongace buňky. (Aaron M, Charbon G, Lam H, Schwarz H, Vollmer W, Jacobs-Wagner C. (2007) The tubulin homologue FtsZ contributes to cell elongation by guiding cell wall precursor synthesis in Caulobacter crescentus. Mol Microbiol. 64:938-52.) v Crescentin – podobný intermediáním filamentům – helixy a zakřivení buněk Caulobacter – asymetrické samouspořádávání molekuly – tvar b. v 3. Gliding motility Makoto Miyata, profesor Osaka City University zkoumal klouzavý pohyb Mycoplasma mobile. Za pomoci cytoskeletárních filament udržují nesférický tvar. (They look like schmoos that are pulled along by their heads. How they are able to glide is a mystery.) Miyata, M., Ryu, W.S., and Berg, H.C. „Force and velocity of Mycoplasma mobile gliding.“ J. Bacteriol. 184, 1827-1831 (2002). 4. Hydrofobní proteiny streptomycet opora vzdušného mycelia Microarrays analýzami – identifikace hydrofobních proteinů – chapliny = kostra pro vzdušné hyfy. Sekretovány z cytoplazmy a ukládány do buněčné stěny. 8 druhů Chapliny – kovalentní vazba na PG, hydrofobní a odolná vrstva – studium cytoskeletu S. coelicolor Studium – exprese a funkční specializace jednotl.druhů chaplinů, jejich polymerizace, interakce se složkami buněč.stěny a morfogeneze Související články: I. Molecular Microbiology Vol. 66 Issue 1 Page 174 October 2007 The cell shape proteins MreB and MreC control cell morphogenesis by positioning cell wall synthetic complexes Arun V. Divakaruni, Cyril Baida, Courtney L. White, James W. Gober II. Tamimount Mohammadi, Aneta Karczmarek, Muriel Crouvoisier, Ahmed Bouhss, Dominique Mengin-Lecreulx and Tanneke den Blaauwen. (2007) The essential peptidoglycan glycosyltransferase MurG forms a complex with proteins involved in lateral envelope growth as well as with proteins involved in cell division in Escherichia coli. Molecular Microbiology 65:4, 1106–1121 III. Understanding the shapes of bacteria just got more complicated Terry J. Beveridge Molecular Microbiology, Volume 62, Issue 1, Page 1-4, Oct 2006, doi: 10.1111/j.1365-2958.2006.05358.x IV. 1: Trends Microbiol. 2007 Mar;15(3):101-8. Epub 2007 Feb 1.Click here to read Links Exploration into the spatial and temporal mechanisms of bacterial polarity. Ebersbach G, Jacobs-Wagner C. Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, New Haven, CT 06520, USA. The recognition of bacterial asymmetry is not new: the first high-resolution microscopy studies revealed that bacteria come in a multitude of shapes and sometimes carry asymmetrically localized external structures such as flagella on the cell surface. Even so, the idea that bacteria could have an inherent overall polarity, which affects not only their outer appearance but also many of their vital processes, has only recently been appreciated. In this review, we focus on recent advances in our understanding of the molecular mechanisms underlying the establishment of polarized functions and cell polarity in bacteria. V. doi:10.1016/j.ceb.2006.12.010 How to Cite or Link Using DOI (Opens New Window) Copyright © 2006 Elsevier Ltd All rights reserved. Diversification and specialization of the bacterial cytoskeleton Zemer Gitai^a, ^E-mail The Corresponding Author ^aPrinceton University, Department of Molecular Biology, Washington Road, Princeton, NJ 08544 Available online 18 December 2006. The past decade has witnessed the identification and characterization of bacterial homologs of the three major eukaryotic cytoskeletal families: actin, tubulin and intermediate filaments. These proteins play essential roles in organizing bacterial subcellular environments. Recently, the ParA/MinD superfamily has emerged as a new bacterial cytoskeletal class, and imaging studies hint at the existence of even more, as yet unidentified, cytoskeletal systems. Much as the cytoskeleton is used for different purposes in different eukaryotic cells, the specific identities, functions and regulatory mechanisms of cytoskeletal proteins can vary between different bacterial species. In addition, extensive cross-talk between bacterial cytoskeletal systems may represent an important mode of cytoskeletal regulation. These themes of diversity, species-specificity and crosstalk are emerging as central properties of cytoskeletal biology. VI. The Bacterial Cytoskeleton Yu-Ling Shih and Lawrence Rothfield^* Department of Molecular, Microbial and Structural Biology, University of Connecticut Health Center, 263 Farmington Avenue, Farmington, Connecticut 06032 SUMMARY INTRODUCTION BACTERIAL CYTOSKELETAL ELEMENTS Actin Homologs MreB and MreB homologs. (i) Cytoskeletal organization of MreB proteins. (ii) MreB polymerization and depolymerization. (iii) Cellular functions of MreB and MreB homologs. Plasmid partitioning by an actin homolog: the ParM system. (i) ParM polymer assembly and disassembly. (ii) Mechanism of ParM function. (iii) Filament disassembly and plasmid migration. MamK. Tubulin Homologs FtsZ. (i) The FtsZ ring. (ii) Membrane attachment of the Z-ring. (iii) FtsZ spiral structures. (iv) FtsZ polymerization and depolymerization. (v) Regulation of Z-ring assembly and stability. BtubA/B. (i) BtubA/B polymerization. Microtubule-like structures in Verrucomicrobia. Intermediate Filament Protein Homologs Crescentin. The MinD/ParA Class of Bacterial Cytoskeletal Proteins Subgroup 1: MinD. (i) The MinCDE system. (ii) The MinD cytoskeleton. (iii) MinD structure. (iv) MinD polymerization. (v) Membrane targeting of MinD. (vi) MinD-bilayer interactions. (vii) Dynamic rearrangements of the MinD cytoskeleton. Subgroup 2: type I plasmid partitioning proteins. (i) ParA/B proteins in plasmid partitioning. (ii) ParA cytoskeletal structures. (iii) ParA polymerization. (iv) ParA oscillation. Soj. Other Filamentous Intracellular Structures Spiroplasma melliferum fibrillar structures. Treponema phagodenis cytoplasmic filaments. Myxococcus xanthus intracellular filaments. Mycoplasma pneumoniae filamentous structures. Miscellaneous intracellular structures. HELICES, HELICES, AND MORE HELICES SetB Sec Proteins Tar Outer Membrane Components Why Is the Helical Distribution Pattern So Popular? EUKARYOTIC AND PROKARYOTIC CYTOSKELETAL ELEMENTS Properties and Functional Relationships Membrane-Associated Cytoskeletal Structures CONCLUSIONS AND SUMMARY ACKNOWLEDGMENTS REFERENCES Půčící buňky Hyphomycrobium prostéka Charakter sporangií aktinomycet Životní cykly s pravou diferenciací A. vláknité sinice n heterocysty n akinety n vegetativní buňky Heterocysty u nejsou v pravém smyslu součástí cyklu – dead-end cells u nejsou schopny dělení ani klíčení u slouží k fixaci molekulárního dusíku – ochrana anaerobní, ke kyslíku citlivé nitrogenázy u existují v těsném spojení s vegetativními buňkami Heterocysty n buněčná stěna je chráněna obalem s glykolipidovou a polysacharidovou vrstvou n mikroplazmodesmata spojují obě buňky u přesun disacharidů do heterocystyredukovaný ferredoxin přenáší elektrony nitrogenáze Akinety n klidové rezistentní stadium n větší buňky s tlustou stěnou n rezistence vůči vysychání a fyzikálnímu porušení n často v řetízcích n vegetativní buňky se přeměńují v akinety na konci exponenciální fáze Životní cyklus n akinety klíčí a vyrůstají z nich vegetativní buňky, v řetízcích n za nedostatku využitelného dusíku se v řetízku tvoří heterocysty – zhruba každá sedmá buňka n po průchodu exponenciální fází se vegetativní buňky mění v akinety B. Pleurocapsaceae 1. Dermocarpa n baeocyt – buňka s tlustým obalem u roste, zvětšuje svoji velikost až 1000x u když dosáhne maximální velikosti, dojde k mnohonásobnému dělení uvnitř útvaru u rodičovská buňka praská u uvolňují se nové baeocyty – drobné, pohyblivé klouzavým pohybem, fototaktické n vytvoření pochvy – přisednutí k pevnému podkladu 1. Dermocarpella n asymetrické dělení ovoidního baeocytu n větší buňka prochází mnohonásobným dělením za vzniku baeocytů, menší buńka zůstává obalena pochvou a přisedlá n praská pouze větší buňka Tvary bakteriální buňky Tyčky: - malé: Serratia marcescens - velké: B. cereus - řetízky: B. mycoides - koryneformní – Corynebacterium - tyčky ---- koky: Arthrobacter crystallopoietes Vlákna: Streptomyces griseus Caulobacter crescentus Kolonie: - hladké smooth – S. marcescens, P. fluorescens - drsné rough: B. subtilit - mukoidní: Azobacter vinelandii - rhizoidní: B. mycoides Životní cyklus Arthrobacter - G+, 0,6-1,0 x 1-3, Micrococcaceae, může se rychle odbarvovat - Rostou 10-35°C, největší podíl při stanovení počtu bakterií v půdě. Počet klesá s rostoucí kyselostí půdy - Růstový cyklus: tyčka – kok Grampozitivní tyčka se v průběhu cyklu mění v kok (ve stac.fázi 2-7dní). Po přenesení do čerstvého media „pučí“ a produkují další buňky – nepravidelné tyčky (exponenciální fáze). Některé buňky tvoří dvojice ve tvaru L nebo V, většinou pravoúhlé. Může se objevovat primární větvení, ne pravé mycelium. V některých kulturách se při určitých poměrech N/C tvoří velké, kulaté buňky, spory (klidová stadia?) Růstový cyklus je morfologickým znakem – ke sledování musí být použito vhodných medií (yeast pepton agar) Ancylobacter aquatis Alphaproteobacteria, čeleď Xanthobacteraceae, rod Ancylobacter - nepohyblivé G- zakřivené bakterie, 0,3-1 x 1-3, starý název: Microcyclus, sk. I B I: respirační metabolismus, zakřivený C tvar, mohou tvořit prstýnky – za běžných kultivačních podmínek překryvem buněk B: příležitostně tvoří prstýnky, netvoří šroubovice a vlákna, mohou tvořit plynové Vakuoly – při 20°C - enkapsulované buňky, nejsou klidovými stadii. Využívají methanol a formiát, aerobní - 5-37°C - kolonie: průsvitné – opalescentní – bílé - kultivace: definované medium: (NH4)2 SO4 Arthrobacter crystallopoietes CCM 2386, médium č.1, 30°C, 2 dny. Arthrobacter crystallopoietes CCM 2386, Gramovo barvení, médium č.1, 30°C, 24h. Ancylobacter aquaticus CCM 2549, Gramovo barvení, médium č.46, 28°C, 3 dny Ancylobacter aquaticus CCM 2549, médium č.46 (Ancylobacter - Spirosoma medium) 28°C, 4 dny. B. Pohyb bakteriální buňky Spirochety – axiální filamenta v periplazmatickém prostoru Klouzavý pohyb – sinice (cyanobacteria), Myxobacteriales, Cytophagales, mykoplazmata - nemá předurčeny speciální struktury - 3 μm/s - myxobakterie: 3 genové oblasti – pohyb individuální buňky, společný pohyb buněk a usídlení – agregace (tato třetí skupina genů je úzce příbuzná genům pro MCP systém! Pohyb je odpověď na: chemické látky, teplotu, světlo, gravitaci, kyslíkový gradient Chemotaxe: Pohyb bez atraktantu – střídání přímého a otáčivého, vrtivého. Náhodný. Pohyb s atraktantem – nižší frekvence otáčení na místě Bakterie disponuje pamětí na okamžitou koncentraci atraktantu: porovnává prostředí s předchozí koncentrací – ve směru zvyšující se koncentrace se snižuje frekvence otáčení na místě. § Pozitivní (pohyb k atraktantu) a negativní – pozorování na Petriho misce § Koncentrační gradient § Chemoreceptory – v periplazmě nebo na cytoplazmatické membráně § Atraktanty: O/ cukry (odpověď už na 10^-8 M koncentraci), aminokyseliny; O/ 20 chemoreceptorů § Repelenty O/ bakt.odpadní produkty, inhibiční agens, barviva, chemické látky O/ 10 chemoreceptorů Závislost na prostředí: MCP systém čeledi Enterobacteriaceae je urč.způsobem vyvinut u druhů žijících v prostředí bohatém na živiny, liší se tedy od systémů recepce např.u oceánských bakterií: Vibrio furnissii – živí se chitinem, vykazuje, silná odpověď na nízké koncentrace oligosacharidů chitinu, nikoli na silné atraktans např.pro enterobakterie (aspartát). Fotosyntetické Chromatium – přitahováno H[2]S (donor elektronů), což je repelent pro většinu bakterií. H. halobium přitahováno leucinem, což je repelent pro enterobakterie. Rhodopseudomonas putida – chemoatraktantem jsou repelenty enterobakterií (benzoát) MCP systém není ovlivňen růstovým cyklem buňky, , není zahrnut v údržbě buňky, ale při zvýšené intenzitě růstu. – pohyb hraje roli při kompetici limitujících zdrojů. Chemotaxe hraje roli u adherovaných buněk Caulobacter – volné plovoucí buňky – není syntéza DNA, ani dělení, ale exprese MCP – podobných receptorů – silná chemotaxe. Pohyb za signály, dokud nenarazí na povrch bohatý na substrát – osídlení a iniciace buněčného dělení. Aerotaxe: Jedna z nejdříve popsaných taxí. (1883, Engelmann). Fototaxe: Fotokineze je snížení či zvýšení rychlosti odpovědi na změny intenzity světla. Pozitivní fototaxe ve směru nižší intenzity světla. Akumulace ve stinném prostředí. Sinice – velikost buňky umožňuje vnímat směr světla. Bakterie – fotofobní.