Somatické kmenové buňky ­ SSCs
(Somatic stem cells)
- Podílejí se na regeneraci tkání, orgánů a homeostázi obecně
- Mnohé jsou minimálně multipotentní
- Kromě profesionálních SSC, existuje i množství fakultativních typů
- Případná pluripotence nebyla dosud prokázána
Jak vypadají, jaké mají vlastnosti a schopnosti ?
Mají adultní SSCs stejný potenciál jako embryonální SSCs?
Jsou všechny stejné, podobné, tkáňově specifické ?
Lze je kultivovat in vitro ?
Kde se nacházejí?
Jsou nesmrtelné?
,,Existují?"
Embryonální somatické kmenové buňky
- Během embryogeneze dávají vznik tkáním a orgánům
- Případná pluripotence nebyla dosud prokázána
- Během časné embryogeneze se intenzivně dělí, později již méně (???)
- Lze je izolovat a množit in vitro (zatím pouze po omezenou dobu)
- Pravděpodobně jsou schopné transdiferenciace (?)
- Tvoří solidní nádory (možná i teratomy?!?) po injikaci do imunitně
tolerantního organismu (všechny ??)
- Ačkoliv jsou v mnoha ohledech podobné somatickým kmenovým
buňkám z dospělého organismu (mnohé znaky, podmínky
kultivace a izolace), zdá se, že stejné nejsou.
ADULTNÍ x EMBRYONÁLNÍ
somatické kmenové buňky
Původ SSC
Biologie SSC
kmenové buňky
(aktuální)
potenciální
kmenové buňky
přechodně se dělící
progenitory
funkční
terminálně
diferencované buňky
přechodně se dělící buňky
Odhad generačních cyklů od kmenové buňky po funkční / terminálně diferencovanou
buňku pro různé typy tkání u myši
NICHE a jak být profesionální kmenovou buňkou
Stejně jako je v současnosti obtížné fyzicky uchopit jednotlivou SSC je velice těžké poznat,
jak vypadá a jaké vlastnosti má prostředí, kde se SSCs nachází = niche. Profesionální SSCs
mají tzv. nezralý fenotyp, tj. připomínají buňky značně časných vývojových stádií
(z hlediska vývoje organismu / ontogeneze). Předpokládá se, že v závislosti na potřebách
organismu buď vůbec neproliferují nebo jen pomalu. Intenzivnější proliferace se
předpokládá v odpověď na poranění dané tkáně případně její jinou nedostatečnost. Tato
proliferace, v odpověd na poranění, je in vivo u některých tkání, např. nervové, značně
nedostatečná a tkáň má tak velice malou schopnost regenerace, na rozdíl např. od epitelů.
Pro mES je ,,niche" feeder + LIF + nedefinované faktory séra (BMP není plně
dostatečné z dlouhodobého hlediska). Je to jediný ,,dokonalý" niche který umíme navodit
v in vitro podmínkách, paradoxně u kmenových buněk, které přirozeně neexistují. In vitro,
však při vhodné manipulaci a za dodržení výše uvedených podmínek mES představují
nejhomogenější a ve vlastnostech i nejstálejší populaci kmenových buněk (2007 :o)).
Zánik niche = zánik/diferenciace kmenové buňky. Opačný proces, navození niche (kdyby
jsme ho znali) kolem progenitoru nebo terminálně diferencované buňky nevede ke vzniku
buňky kmenové (analogicky k pokusům s ES a dalšími o SSCs ,,obohacenými" populacemi
SSCs. Je to pravděpodobně v důsledku ireverzibilně (z pohledu možností extracelulárního
působení) změněných regulací ,,intrinsic" faktorů, které si SSCs zachovávají z časných
vývojových stádií ontogeneze. Toto dokazují i pokusy s exogeními expresemi takových
faktorů v různých populacích dělících se buněk (viz. reprogramování buněk).
Co v NICHE najdeme?
růstové faktory, proteiny extracelulární matrix, povrchy buněk / buněčný
kontakt, hypoxie, nedostatek živin?
Podobně jako se zdají být SSCs tkáńově/orgánově specifické,
budou specifické i jejich ,,niche".
Naveiras, 2006
Jak očekáváme, že profesionální SSCs vypadají
- Měly by exprimovat ,,stemness" geny (které to ale jsou?), analogické geny s ES
buňkami nebývají tak silně exprimovány, jak to známe právě u ES buněk,
pravděpodobně tu hraje svou roli pluripotence ES buněk oproti multipotenci SSCs,
kdy tzv. ,,stemness" geny ES buněk jsou spíše geny exprimované pluripotentními
buňkami obecně.
- Předpokládáme, že mají vysokou hladinu inhibitorů cyklin-dependentních kináz
(p21waf1/cip1, p15INK4B, p16INK4A, p18INK4C) => pomalá proliferace / semi-quiescence.
- Z ,,extrinsic" faktorů se předpokládá významná úloha drah TGF rodiny, Wnt, Notch,
a gp130, v souvislosti s vlastnostmi ,,niche" pak také signalizace přes kadheriny
a buněčné adhezivní molekuly (CAM ­ cell adhesion molecule) v jejichž signalizaci
jsou MAPKs, -catenin, NFB,...
- Jsou obecně odolné k toxinům (MDR - multidrug resistance proteins, ATP pumpy),
ale i k tvrdému záření (paprsky X, -záření).
SSC ,,mezodermálního" původu
Mezenchymální kmenové buňky
(MSCs - mesenchymal stem cells)
Hematopoetické kmenové buňky
(HSCs - hematopoietic stem cells)
krevní elementy, +buňky tkání mezodermálního původu,
snad i krevní elementy, asi ne buňky ledvin, +
HSCs (krev, ? jaterní buňky, kardiomyocyty, ...?)
BMSSCs (chrupavka, kost, stroma kostní dřeně, vazivo,
?svaly, nervy,...?)
MAPCs (??? pluripotent ???)
Endoteliální kmenové buňky
Něco dalšího ?
Zdrojem adultních SSC mezodermálního původu je zejména kostní dřeň
Adultní multipotentní progenitorové buňky ­
MAPCs (multipotent adult progenitor cells)
- ,,Jejich existence je velice kontroverzní"
- propagátorkou je Catherine M. Verfaillie (Jiang, 2002)
- MAPCs byly poprvé izolovány z kostní dřeně, později i z mozku a svalů
- na rozdíl od ostatních SSC jsou to proliferující buňky s vysokou aktivitou telomerázy
- v kultuře lidských a krysích MAPCs nebyly nalezeny aneuploidie, u myší ano
(u myší časté i pro jiné buňky včetně ES???)
- v kultuře in vitro vyžadují ,,nízkou" denzitu (m, r 500-1000 b./cm2; h 1500-3000 b./cm2)
- velmi náročná kultivace (fibronectin, EGF, PDGF, LIF, velké objemy pro obdržení
dostatečného množství buněk pro analýzu)
- in vitro dávají vznik řadě typů buněk včetně neurálních,
čistota diferencované kultury 70-80%
- in vivo, po injikaci do blastocysty tvoří chiméry (schopné narození )
s chimerismem 1-40%, avšak schopnost tvořit zárodečné buňky nebo celé embryo
(injikace do tetraploidního trofektodermu) nebyla prokázána
- netvoří teratomy
- není jasná jejich existence in vivo
- není známý specifický marker
mES ++++mRex1
m+hES ++++mOct4
mES ++++mSSEA1
HSC ++++AC133h / Sca1*m
HSC ++++Thy1 (CD90/CDw90)
HSC +++-cKit (CD117, SCFR)
HSC +++-CD45 (tyr. fosfatáza)
HSC +++-CD34 (L-selectinR)
MSC +++-CD105 (endoglin)
různé buňky+/-CD44 (H-CAM)
MSC +++-MHC-I
blízké SCexpreseantigen
Fenotyp MAPCs
negativní ,,-", ne vždy negativní ,,+/-", slabá ,,+", mírná ,,++", silná ,,+++"
*Sca1 ­ stem cell antigen, GPI (glykosylfosfoinositolovou) kotvou vázaný
protein v cytoplasmatické membráně zejména ,,velice časných" progenitorů
40% chimerismus u myši s ROSA26* MAPCs
Jiang,2002
Stanovení -galaktosidázové aktivity
na sagitárním řezu u normální myši (i)
a chimerické myši s ROSA26-MAPCs (j).
* ROSA26 myši exprimují ve všech buňkách
-galaktosidázu (transgení myši - GMO)
mozek
koster. sval.
játra
ledviny
kůže
srdce
tenké střevo
slezina
Mezenchymální kmenové buňky ­ MSCs (mesenchymal stem cells)
Kmenové buňky kostní dřeně ­ BMSSCs (bone marow stroma stem cells)
Kmenové buňky svalové tkáně, chrupavky, kosti, ....
Caplan, 2001
- MSC lze izolovat z mezenchymálních tkání (kostní dřeň, svaly, dermis, tuková tkáň,
chrupavky, kosti, ale i z krevního oběhu (zde se někdy označují jako pericyty),
zejména však z kostní dřeně.
- Přesný fenotyp není znám, pracuje se se směsnou populací buněk, která po indukci
příslušnými kombinacemi růstových faktorů je schopna dát vznik buňkám dané tkáně.
- Na rozdíl od MAPCs exprimují proteiny MHC-1, a byly připraveny protilátky (SH2, SH3
a SH4) se zvýšenou afinitou k MSCs.
- S věkem jich v organismu ubývá.
- Jsou komerčně dostupné, jejich aplikace v medicíně je ve fázi klinických zkoušek.
- Přes velkou snahu mnoha týmů, pluripotence nebo transdiferenciace v buňky jiného
zárodečného listu nebyla dosud potvrzena.
MSCs
TKÁNĚ
homeostáze
regenerace
BIOAKTIVNÍ
FAKTORY
imunosuprese
podpůrné/růstové faktory
(TROPHIC)
Mechanismus zapojení MSCs v regulaci homeostáze
Mechanismu nepřímého zapojení MSCs (a jejich derivátů?) do procesů regenerace
jako lokálního zdroje růstových faktorů
Caplan,2006
MSCs se aplikují v případě
- infarkt myokardu
- reparace tkáně menisku
- Crohnova nemoc (imunosuprese)
Kmenové buňky stroma kostní dřeně ­ BMSSCs (bone marrow stroma stem cells)
- nejasný fenotyp, ale snadno získatelné ve směsných populacích z kostní dřeně, jako
buňky adherující na plastik pro tkáňové kultury (na rozdíl od buněk hematopoetických řad)
- fibroblastům podobné buňky (a) větší, fibroblastům podobné a b) menší, zřejmě
progenitory)
- MAPCs jsou někdy označovány jako podskupina (subset) BMSSCs
(pluri- x multipotentní???), celkově se ale překrývají s MSCs, obecně je možné, že rozdíly
mezi typy jsou dány spíše selekcí, způsobem izolace a nasměrováním k některé
diferenciační dráze, než skutečnými rozdíly in vivo.
- v závislosti na kultivačních podmínkách velmi rychle mění morfologii, což pravděpodobně
vedlo k podezření na jejich pluri-/multipotentní schopnosti (zejména vznik neurálních b.)
Stromální buňky kostní dřeně
potkana
- izolovány z různých tkání jako buňky schopné intenzivně vylučovat DNA vázající
fluorochrom Hoechst 33342, díky tzv. proteinu rezistence k farmakům = Abcg2
(BCRP ­ breast cancer resistence protein; rodina ,,multidrug resistance transporter
proteins"-MDR; obecně ABC (ATP binding cassette) transportery)
- později prokázán fenotyp Sca1+/lin+---), byly isolovány z mnoha typů tkání i z nádorových
(mléčné žlázy, plíce, svaly, srdce, játra, mozek, kůže a to jak u myši, potkana i člověka)
- Jsou detekovatelné i v některých nádorových buněčných liniích
(C6 ­ gliom; IMR-32, JF ­ neuroblastom; a různých gastroitestinálních nádorových líniích)
Přes výše uvedené společné znaky SP buněk,
jsou tyto buňky tkáňově specifické (???)
- SP svalů mají myogení (Sca1+/CD45-) a hematopoetický potenciál (Sca1+/CD45+)
- Hematopoetické SP jsou Sca1+/CD34+
- SP kůže jsou Sca1+/K14+/K19+
- SP z mozku, ale i pankreatu (!) jsou Sca1+/nestin+
- .....
Populace vedlejších buněk (SP - side population) = SP buňky
V současné době nejsou plně objasněny vztahy/hierarchie mezi
MSCs ­ MAPCs ­ BMSSCs ­ SP a dalšími somatickými kmenovými buňkami
Je možné, že mnohé pozorované rozdíly jsou dány postupy izolace daných buněk,
jejich kultivací in vitro nebo případně i dalšími nedostatky v přípravě vzorků apod.
- v embryogenezi somity ­> myotom ­> myocyt ­> svalové vlákno
- v dospělosti MuSC -> satelitní buňky -> myocyt ­> svalové vlákno
(kostní dřeň) (povrch svalového vlákna)
- MuSC nejsou přesně definované, náleží zřejmě k užšímu výběru MSC
- in vivo je sval regenerován satelitními buňkami, majícími vlastnosti SC
- satelitní buňky se u myši objevují 17.5 dpc., s nástupem tvorby
sekundárních svalových fibril (13 dpc. objevení primárních sv. fibril)
Svalové SC ­ kmenové buňky kosterní svaloviny = MuSC
Původ satelitních buněk
Dále byly izolovány z adultního
kosterního svalu buňky CD34+/Sca1+ jako
kmenové buňky odvozené ze svalu
(MDSCMDSCMDSCMDSC ­ muscle derived stem cells)
Dynamika regenerace kosterního svalu
Mechanismus regenerace svalového vlákna
MuSC/satelitními buňkami (MSC)
MPC ­ myogení progenitor
Pax-7
M-cadherin
desmin
jádra
Morgan2003
Morgan2003
Shi2006
sarkolema 
bazální membrána 
Shi2006
Satelitní buňky kosterní svaloviny
a
jejich úloha v regeneraci svalu
Morgan2003
Mechanismus regenerace svalového
vlákna satelitními buňkami.
Aktivace satelitních buněk (IGF 1,2, HGF,..)
Fůze satelitních buněk
Regenerace svalového vlákna
+--MyoD*
++-Myf-5
++-CD34 (L-selectinR)
++-m-cadherin
+++cMet (HGFR)
+++++Pax-7
Satelitní buňky
aktivované
Satelitní buňky spící
(quiescentní)
Satelitní buňky
spící, časné?
(quiescentní)
marker
* Overexprese MyoD u fibroblastů je diferencuje do myogeních buněk
Hematopoetické kmenové buňky ­ HSCs (hematopoietic stem cells)
Hematopoéza + ?
?!?!
HSC
- Hematopoéza je v současné době zřejmě nejlépe prostudovaná diferenciační dráha
s nejdokonalejším fenotypovým rozlišením jednotlivých buněčných stádií buněk
tzv. CD (cluster determinants) antigeny.
- Jednotlivé diferenciační dráhy jasou často majoritně závislé na jediném cytokinu
(kolonie stimulujícím faktoru ­ CSF; např. G-CSF, faktor stimulující tvorbu zejména granulocytů)
- V průběhu ontogeneze je hematopoéza realizována jedinečným způsobem
(časo-prostorově, viz. níže), což dobře umožňuje i studium rozdílů mezi embryonálními
a adultními somatickými kmenovými buňkami. Každopádně v průběhu embryonálního
vývoje vznikají jisté typy populací T-lymfocytů, které zůstávají po celý život jedince,
ale v dospělosti již nevznikají. Druhou možností, vedle možnosti odlišnosti
embryonálních a adultních HSCs je schopnost těchto buněk osidlovat odlišné ,,niche".
- HSC vzniklé ve žloutkovém váčku také migrují do oblasti AGM a do jater, kde dávají vznik
adultním HSC (Samokhvalov, 2007)
- Harrison et al. (1979): transplantoval myším opakovaně identický štěp HSC déle jak 8 let
- > výrazné překročení délky života myši!!!
HEMATOPOÉZA
Vznik krevních ostrůvků ve vznikajícím
žloutkovém vaku mezi mezodermem
a buňkami viscerálního entodermu
Lokalizace, změna ,,niche" u hematopoézy v průběhu ontogeneze
~7.5 dpc
Hematopoéza v endotelu aorty (AGM), ~10.5 dpc
Kostní dřeň, ~15 dpc
S vývojem kostní dřeně
se HSCs usazují v jejím
stroma.
MOUSEMOUSEMOUSEMOUSE
HSC
HSC
CFU-GM
BFU-E
CFU-E
JJJJÁÁÁÁTRATRATRATRA
THYMUSTHYMUSTHYMUSTHYMUS
pT
pT
pB
pT
pB pT
pT, pB ­ lymfocytární progenitory
CFU-GM ­ myeloidní progenitory
BFU-E, CFU-E ­ erythroidní progenitory
~11 dpc
Podíl jednotlivých tkání na celkovém objemu
hematopoézy mezi 11 ­ 13 dpc u myši
Místo vzniku krevních ostrůvků (blood
island) v průběhu embryogeneze u myši
Pozn. Slezina je osídlena HSCs
a hematopoetickými progenitory
pravděpodobně z jater, protože
v době objevení se hematopoézy
ve slezině, v žloutkovém vaku a
v aortě už hematopoéza neprobíhá
a kostní dřeň dosud není vyvinuta.
Schema vývoje AGM (aorta-gonads-mesonephros)
- začátek fetální hematopoézy
8.524cirkulace krevních buněk
1577kostní dřeň
1348slezina
1142játra
1140thymus
9.527dorsální aorta
7.518žloutkový vak
~21~270embryonální vývoj (dny)
myščlověkhematopoéza/lymfopoéza
(dny)
Chronologie hematopoézy u člověka a myši
--+CD243 (MDR-1)
++-CD228 (Melanotrensferrin)
-+-CD227 (MUC-1)
-+-CD176 (Thomson-Friedrenreich antigen)
-+-CD174 (Lewis Y)
-+-CD173 (krevní skupina H typ 2)
--+CD135 (Flt3/Flk2)
-+-CD133 (Ac133)
-+-CDw131 ( řetězec IL-3R/IL-5/GM-CSF)
+--CD127 ( řetězec IL-7R)
+--CD124 (IL-4R/IL-13R)
-++CD123 ( řetězec IL-3R)
+++CD117 (c-Kit, SCFR)
-+-CD112 (Nectin2)
-+-CD111 (Nectin1)
-++CD110 (Trombopoietin receptor)
+-+CD90 (Thy1)
+--CD38 (ecto-ADP-ribosyl cyclase)
++-CD34 (L-selectinR)
-+-CD33 (Sialoadhesin)
+--CD10 (CALLA)
Lymphoid SCMyeloid SCHSCantigen
Fenotyp HSC
Extrinsic a intrinsic faktory regulující
sebeobnovu adultních HSC (Okala, 2006)
Schema hematopoézy a fenotyp
aktuálních a potencionálních HSC
Kmenové buňky v pupečníkové krvi (v allantois)
7.5 dpc 12.5 dpc
Pupečníková krev obsahuje hematopoetické progenitory existující, jako pozůstatek
extraembryonálních krevních ostrůvků a endotelie. Díky tomu, jsou tyto buňky geneticky
shodné a fenotypově velice blízké vlastním krevním buňkám embrya a je možné je tak
snadno použít jako transplantační štěp pro z tohoto embrya vzniklého jedince. Jejich
množství lze navíc navýšit indukcí jejich proliferace koktejlem pro-hematopoetických
cytokinů.
V současnosti bylo publikováno, že pupečníková krev může být také zdrojem
mesenchymálních buněk, snad podobné MSCs i s jejich potencí. Tyto výsledky je však
třeba ještě důkladně ověřit.
Endotel
- jednovrstevný dlaždicovitý epitel tvořený endotelovými buňkami adherovanými
k bazální membráně
- tvoří výstelku cév případně cévy samotné (mikrokapiláry)
- v případě cév jsou z druhé strany bazální membrány buňky hladké svaloviny
a podle typu orgánu také množství pericytů (viz. mesenchym), pericyty jsou
i v mikrokapilárách
- endotel je prostupný pro pericyty, monocyty/makrofágy, leukocyty a lymfocyty
- endotel je také významným zdrojem mnoha růstových faktorů, díky tomu hraje
významnou úlohu v homeostázi dané tkáně
- obnova endotelu probíhá z endotelových progenitorů (kmenových buněk?),
které jsou vmezeřeny mezi endoteliemi, případně plavou v krevním řečišti.
- některé práce ukazují na společného předchůdse endotelií a HSCs
(CD31+/- ­ PECAM1 (Platelet endothelia cell adhesion molecule 1), CD34+, CD45+)
případně také na schopnost vzájemné transdiferenciace těchto dvou buněčných
populací. Adultní progenitory pro hematopoézu a endotelie byly isolovány
z krve a kostní dřeně s fenotypem CD34+, Flk-1+, AC133. Podobně bylo
prokázán společný progenitor v průběhu embryogeneze pro endotelie
a buňky hladké svaloviny. Jestli takový progenitor existuje i v dospělosti není
dosud známo.
Armulik 2006
Srdec, srdeční sval a jeho regenerace
Kardiomyocyty + Endotelie + specializované svalové buňky Hisova svazku
a Purkyňových vláken + SP apod.?? + vazivo (fibroblasty)?
Srdeční sval může mohutnět zejména hypertrofií svých buněk, ne jejich namnožením,
a tak možnosti autonomní regenerace po poškození jako je infarkt myokardu, ischemie
apod.., jsou značně omezené. Proto jsme se domnívali, že myokard neobsahuje
zásobu progenitorů k reparaci. Navíc se výraznější dělení kardiomyocytů zastaví časně
po narození, stanou se senescentními a jejich počet se během života již za normálních
okolností zásadně nezvětšuje.
Některé recentní práce však ukazují, že i u srdce můžeme předpokládat jisté
regenerační schopnosti, a to buď díky zbytkovým progenitorům nebo schopností
(některých?) kardyomyocytů proliferovat v odpověď na poškození.
Byla také prokázána schopnost regenerace srdce cirkulujícími progenitory,
jak ukazují sex-mix transplantace srdce. Analýza distribuce X chromosomu ukázala,
že se pravděpodobně nejedná o fůzi buněk, ale o diferenciaci progenitorů (SCs ?),
přesto jiné práce prokázali jen fúzi mezi buňkami.
- využití transplantátů např v podobě kardiomyocytů získaných z ES buněk je zdá se
komplikovanou jinou synchronizací tepu.
1) MSCs, SP buňky, BMSSCs, MAPCs, se ¨v malém množství vyskytují i v krevním
řečisti. V návaznosti na požkození organismu, podle některých teorií, se počty těchto
buněk v krvi zvětšují.
2) ,,Signál poškozené tkáně". Cirkulující (i např MSCs / BMSSCs) progenitorové
a kmenové buňky mají tendence (zřejmě podobně jako buňky imunitního systému)
akumulovat se v poškozené tkáni. Podstata tohoto signálu není přesně známa.
Zřejmě je však podobného charakteru jako známe z imunitních reakcí a z procesů
regenerace (chemoatraktanty ­ chemotaxe, pathotaxe)
3) Je podezření, že endotel může dávat vznik hematopoetickým progenitorům (viz.
např. hematopoéza v stěně dorsální aorty (AGM) embrya a extraembryonální prvotní krevní
ostrůvky průběhu embryonálního vývoje atd..
Tyto regenerující buňky jsou pravděpodobně SP a c-kit+ buňky kostní drěně
(MSCs?)1), i po injikaci, se přednostně usazují např. v místě ohraničujícím infarkt2).
Mechanismus regenerace srdečního svalu nemusí však být spojen přímo s
diferenciací těchto zde se akumulujících buněk, ale může být vyvolaný také růstovými
faktory, které tyto buňky produkují (viz. MSCs) a tak stimulují buď samotné
kardiomyocyty, nebo a to spíše endotelové buňky vystýlající místní cévy. Endotel
snad sám o sobě má regenerační schopnosti pro některé tkáně3). Není však dosud
jasné zda tento regenerační (transdiferenciační ?) potenciál mají samotné endotelie
nebo další typy buněk nacházející se v přímém kontaktu s endotelem (SP buňky,
MSCs?, fibroblasty).
Detekce buněk v srdeční svalovině exprimujících
c-kit (zelená) MDR1 (růžovo-fialová) Sca1(žlutá)
von Willebrandův faktor (bílá)
Progenitory ,,kmenové buňky"
z krevního oběhu
Spící progenitory
kardiomyocytů (SCs?)
Proliferace kardiomyocytů
Hypotetické možnosti regenerace srdečního svalu
Kostra - skelet
chrupavka (chondrocyty) + kost (osteoblasty a osteoklasty)
- vývoj končí v pubertě
klidová zóna
proliferační zóna
růstová zóna
MESODERM
MSC
HSC
chondrogeneze
chondrocyty
?
osteoblast
(mineralizující)
Osteocalcin
*Runx2 -/-, jen chrupavka
osteoklastENDOTEL
apoptóza
vaskularizace
osifikace
osteoblast
Runx2* -> Osx
Fos, Fos, Fra-1
-- ontogeneze
-- regenerace
?
?
klidová zóna
růstová zóna
chondrogeneze
chondrocyty
proliferační zóna
fenotyp chondrocytů v průběhu jejich diferenciace
kolagen II
kolagen X Sox9*
L-Sox5,Sox6
Runx2
Ihh
PTHrP
Fgfr3
* Sox9 aktivuje expresi kolagenů typu II, IX, XI
Sox9 -/-, nevznikají chondrocyty
tmavší = výší exprese
Ihh ­ Indian hedgehog
PTHrP ­ od parathyroidního hormonu
odvozený peptid (PTH-related peptide)
Fgfr3 ­ receptor 3 pro FGFs
Ledviny
- velice malá schopnost regenerace
- složitý vývoj, různá regulace a odlišné typy buněk mezi pronefros,
mesonefros a metanefros
- multipotentní buňky, kultivovatelné in vitro a integrující se v různých
oblastech ledviny objeveny ve stěně renálních papil (Oliver 2004)
- klíčové geny pro vznik ledvin: lim1 (homeoboxový gen); transkripční faktory
Pax2, Pax8
- geny klíčové pro regulerní vývoj ledvin: Wnt4, BMP7; transkripční faktor
FoxD1, pod-1; PDFG/PDGFR
SSC ,,entodermálního" původu
Játra a pankreas
Během embryogeneze vznikají játra a pankreat ze společného progenitoru/kmenové buňky.
Přítomnost takové buňky v dospělém organismu, však nebyly dosud prokázána.
Játra
a) vlastní jaterní buňky
hepatocyty (albunim), oválné buňky (vlastní jaterní kmenové buňky, c-kit, SCF, Thy1
albumin / CK19), epiteliální buňky žlučovodu (CK19), hvězdicovité buňky
b) další typy buněk v játrech
endotelie, krevni elementy, Kupferovy buňky, SP buňky,..
Jaterní tkáň běžně regeneruje proliferací vlastních hepatocytů (hepatotektomie),
případně proliferací a diferenciací oválných buněk (otravy, požkození chemikáliemi).
Jednotlivé typy buněk jsou jsou preferovány podle typu požkození. Hlavní
proliferaci indukující faktor je HGF (hepatocyte growth factor), na celkové regulaci
regenerace se pak podílejí i IL-6 (interleukin 6), TNF (tumor necrosis factor ),
TGF (transforming growth factor ), EGF (epidermal growth factor )
- regenerace jater HSCs: c-kit+++, Thy+--, Lin-, Sca1+ (fenotyp KTLS)
z kostní dřeně tvoří po transplantaci do jaterní tkáně, zdá se funkční hepatocyty
- regenerace jater MAPCs a BMSSCs: MAPCs se usazují v játrech (chiméry
i transpalntace) a i in vitro dávají vznik hepatocytů (?!). BMSSCs, se usazují v
játrech, ale zdá se, že zejména fůzují s tamními hepatocyty (časté karyotypy
při sex-mix transplantacích jsou XXXY a XXXXYY). Plná funkčnost těchto MAPCs
a BMSSCs derivátů však zatím nebyla prokázána.
Model zapojení se HSCs / hematopoetických progenitorů
v regeneraci jater
oc ­ regenerace z oválných buněk
nt ­ normální obnova jaterní tkáně
pt ­ obnova jaterní tkáně po odstranění její části
Pankreas
a) exokrinní buňky (trávicí enzymy) a epiteliální buňky tvořící kanálky
pro odvod těchto enzymů do dvanáctníku
b) endokrinní buňky  (glukagon),  (insulin),  (somatostatin) a pp-buňky
(pankreatický polypeptid)
- prekurzor pankreatu (embryonální SC) exprimuje transkripční faktor ,,pdx1"
- poslední studie ukazují, že  buňky se neobnovují z kmenových buněk,
ale svou vlastní pomalou proliferací. Exprimují insulin, Pax6, HNF3,..
- endokrinní buňky mají velice podobný
vývojový program jako buňky neurální
(NeuroD, is11, Nkx2.2, Nkx6.2,...) rozdíl
je zejména v insulinu a pdx1
- epiteliální buňky kanálků se sebeobnovují
podobně také exokrinní buňky acinů
- SCs pankreatu nebyly dosud objeveny
- diferenciace BMSSCs (?) do  buněk byla
jednou prokázána, ale nezopakována
- buňky pankreatu mohou tvořit hepatocyty
u člověka spontálně (in vivo), u potkana
to lze navodit experimentálně, opačně
to nefunguje, avšak exogenní exprese
pdx1 v hepatocytech z nich dělá buňky
exprimující insulin a znaky exokrinních
buněk, podobné i u buněk embryonálního
epitelu střeva
 buňky
Kmenové buňky střevního epitelu
STŘEVNÍ EPITEL (u hlodavců se kompletně obmění ~ po 4 dnech)
pohárkové buňky ­ hlen
Panethovy buňky ­ bakteriocidní faktory (lysozym, defensiny + TNF)
epiteliální buňky (apikální mikrovili) ­ resorpce
Neuro / enteroendokrinní buňky ­ peptid. hormony
M-buňky ­ přenos antigenu k lymfocytům Peyerových plátů
kmenové buňky střevního epitelu
mesenchymální buňky ,,lamina propria"
fibroblasty, fibrocyty, endotelie, buňky hladké
svaloviny, a střevní subepiteliální myofibroblasty
- ISEMF (intestinal subepithelial myofibroblast)
které produkují růstové faktory regulující
proliferaci a diferenciaci epiteliálních buněk
(HGF, KGF, TGF2)
endokrinní
pohárkové
epiteliální
Panethovy
tenké střevo
tlusté střevo
Předpokládá se, že všechny buňky
každé střevní krypty jsou potomky
jediné kmenové buňky
(klonální studie s chimérami)
Jednotlivé krypty
se pak množí dělením
(dané velikostí krypty)
Nejklíčovějších faktory regulující deferenciaci střevního epitelu
jsou Wnt, BMP a Notch. V případě tlustého střeva také gradient
NaBt, produkovaného bakteriemi v jeho lumen.
APC ­ adenomatous polyposis coli
Pozn. MSCs/BMSSCs se mohou integrovat do střevního epitelu, ale neplní
zde funkci epiteliálních buněk. Integerují se i do lamina propria, tvoří ISEMFs
a produkcí růstových faktorů podporují proliferaci střevního epitelu (viz. MSCs)
Plíce
PLICNÍ EPITEL
(u hlodavců se kompletně obmění ~ po 100 dnech)
Proximální část plic
(trachea a velké průdušnice/bronchy)
- epiteliální buňky s ciliemi (Foxj1+)
- Clara a buňky podobné Clara buňkám
(Scgb1a1 ­ sekretoglobin+)
- bazální buňky (p63+)
- neuroendokrinní buňky
Distální část plic (průdušky, průdušinky a alveoli)
- epiteliální buňky s ciliemi (Foxj1+)
- Clara buňky (Scgb1a1+)
- varianta Clara buněk - Clara V
- neuroendokrinní buňky, tvořící neuroendokrinní
tělíska (NEBs, exprimují
od calcitoninu odvozený peptid ­ Cgrp+)
- buňky typu I a II v alveolech. Typ II produkuje
proteinové surfaktanty, typ I těsně přiléhá ke kapilárám
- bronchoalveolární kmenové buňky (BASCs)
Opravné mechanismy v proximální části plic
basální
buňky (1)
SP buňky?
(2)
epitelie* (3)
* epiteliální buňky submukózních žlaz, mohou regenerovat epitel průdušnic
** nahrazují buňky s ciliemi po požkození oxidanty
Clara** (4)
buňky s
ciliemi (3)
?
BASC
(1,2) ClaraV
(1)
TA
progenitor
TA
progenitor
neuro-
endokrinní
buňky (6)
buňky s
ciliemi (3)
Clara
(4)
typ II
(5)
typ I
???
*
*umí to všechny Clara buňky ?!
naphtalen
NO2
naphtalen
bleomycin
Opravné mechanismy v distální části plic
multipotentí BASCs mají fenotyp
Sca1+, CD34+, CD45-, Sftpc/Scgb1a1+
SSC ,,ektodermálního" původu
Neurální kmenové buňky ­ NSCs
(Neural stem cells)
lokalizace NSCs
a)
b)
a) subventrikulátní zóna (SVZ), postranní komory
b) subgranulární vrstva DG
Gl ­ glomerularní vrstva
Gr ­ granulární vrstva
EPl ­ vnější plexiformní vrstva
Mi ­ vrstva mitral buněk
IPL ­ vnitřní plexiformní vrstva
cc - corpus callosum
LV - lateral ventricle
CPu - caudate putamen (striatum)
DG - dentate gyrus
SN - substantia nigra
C
(TA)
A
(neuroblast)
migrace
E
(ependym)
?
radial
glia*
astrocyt
glia
prekursor
neurony
oligo-
dendrocyt
Shh; Delta/Notch -> Hes
Sox1, 2, 3; Emx2;
Zic1; Pax6
Oblast s NSCs obsahuje čtyři typy buněk
1) pomalu proliferující, astrocytům podobné (GFAP+/nestin+/SSEA1+/CD133+)
buňky - typ B = NSCs
2) intenzivně proliferující buňky vzniklé z buněk B - typ C
(TA progenitory, přechodně/transientně se dělící progenitory)
3) z buněk typu C vznikají buňky A = neuroblasty
4) ependymální buňky - typ E
B
(NSC)
*radiální glie ­ embryo
a časně postnatálně
EGF (in vitro)
embryo
- NSCs jsou široce multipotentní a experimenty s chimérami ukázaly, že NSCs dávají
vznik buňkám všech tří zárodečných listů (netvoří pohlavní buňky, nebylo prokázáno)
- u chimér se také NSCs nepodílí na hematopoéze i přesto, že v případě likvidace
hematopoézy zářením, injikované NSCs ji obnoví (obojí děláno s myšmi ROSA26)
- na druhou stranu není jasné, zda NSCs tvoří všechny typy nervů a glií
- neurální multipotentní progenitory byly izolovány i z retiny, optického nervu,
hypothalamu, čichových laloků, čichového epitelu, a míchy
- tyto směsné populace nejsou schopné dlouhodobé proliferace in vitro tak jako NSCs
a také si zachovávají některé epigenetické znaky podle místa původu
- po poškození mozku je možno neurogenezi detekovat i v striatu, neokortexu nebo
v místech kortiko-spinálních motoneuronů
- NSCs s věkem ubývá, podobně jako ostatní adultní SSCs, každopádně je lze izolovat
z mozkové tkáně i několik hodin (4-6h) po diagnóze klinické smrti
- in vitro se NSCs kultivují v podobě tzv. ,,neurosfér" ve speciálních médiích určených
pro expanzi neurálních progenitorů, bez séra, ale s nadbytkem FGF2 a EGF
- ,,neurosféry" jsou plovoucí útvary s navýšeným množstvím neurálních progenitorů
a NSCs, lze v nich detekovat již i množství zralejších typů nervů i glií
- i neurální progenitory (TA) lze dlouhodobě kultivovat
Další charakterizace NSCs
Chimerická blastocysta
vytvořená po smíchání blastomer normální
a ROSA26 myši a myší embrya (11 dpc)
normální a s ROSA26 chimerické myši.
Epiteliální kožní kmenové buňky ­ ESSCs
(Epithelial skin stem cells)
Kůže ­ dermis (mesoderm -> mesenchym) + epidermis (ektoderm)
ESSCs (Integrin 6+/CD71-/K15+/K19+/CD34+)1 jsou
lokalizovány ve výduti po straně vlasové pochvy.
Odtud v případě potřeby migrují jak do bazální
vrstvy krycí epidermis, tak k základu vlasu
k dermální papile2. V základně vlasu, u dermální
papily, ESSCs vytváří ,,sekundární" populaci
kmenových buněk, odpovědných za růst vlasu.
V basální vrstvě epidermis dávají vznik aktivně
se dělícím keratinocytům, exprimujícím keratiny
K5 a K14. Po jejich přechodu do ,,stratum
spinosum" se tyto keratinocyty přestanou dělit
a nastupují proces terminální diferenciace
kdy keratiny K5/K14 jsou nahrazeny keratiny
K1 a K10. Poté dochází k syntéze bariérových
proteinů jako je involucrin, loricrin,..., zplošťování
buněk a jejich odumírání.
1 CD71 ­ receptor pro transferin
2 dermální papila je shluk mesenchymálních buněk reguljící růst chlupu
ESSC
Tcf3+
pre-ORS ORS*
IRS*pre-IRS
matrix
(dřeň)
pre-cortex
cortex
(kůra)
sebocyt
pre-
sebocyt
commited
epidermis
mazové žlázyepidermis
vlasové pochvy
vlas
BMP
Wnt BMP
Noggin (dermal papila)
Lef1+
GATA3+
Tcf3, Lef1
cytokiny
transkripční faktory
*IRS ­ vnitřní vlasová pochva
ORS ­ vnější vlasová pochva
(inner / outer root sheath)
Specializace a signalizace v epidemis
Morfologie epidermis
a vlasové cibulky
Poznámka.
Epiteliální kmenové buňky
podobné ESSCs byly také
nalezeny v oční rohovce. Tyto
buňky jsou zde pravděpodobně
pouze bipotentní, avšak po jejich
přenosu do epidermis, se chovají
jako ESSCs a jsou multipotentní!
Nádorové kmenové buňky - CSCs
(Cancer stem cells)
Původ CSCs
a) somatické kmenové buňky
b) TA buňky (progenitory)*
Podstatou je akumulace chyb v regulaci
diferenciace, proliferace a apoptósy.
Tyto chyby mohou být jak na základě
poškození/změn DNA (genů ­ mutace,
translokace,..), tak na úrovni
epigenetických mechanismů, případně
kombinací obou.
a
b
=> chybná odpověď na vnější signály
(růstové faktory, proteiny ECM, buňky)
Jordan 2006
* Lze i experimentálně navodit zvýšením exprese oncogenů, např ras + myc.
Jordan 2006
Kmenové buňky nádorů jsou zodpovědné za návrat (relaps) onemocnění a metastáze
CSCs podobně jako jiné SSC -> rezistence na toxické faktory (MDR proteiny)
-> pomalá proliferace
- mají všechny nádory benigní/maligní/metastázující CSC?
- ne všechny buňky izolované z nádorů jsou schopny dávat nádorům vzniknout
- in vitro jsou nádorové linie s SP buňkami (jejich SC ???) i bez SP buněk!
- SSCs jsou pro danou tkáň prakticky stejné, u CSCs to ale neplatí
(rozdíly ve fenotypu i genotypu) = mnohé nádory i CSCs mají jediněčné vlastnosti!
A ­ znázornění progrese nádoru u pacienta
B ­ proliferace x dormance (quiescence) nádorových
buněk v závislosti na aktivitě MAPK Erk a p38
C ­ mechanismus aktivace Erk a p38
Model regulace tumorogeneze
přesmykem aktivity MAPK Erk a p38
Ranganathan 2006
C
Dobře prokázané CSCs jsou u nádorů původu
neurálního hematopoetického prsního
Jordan 2006
Hematopoetické CSCs
chronická myeloidní leukemie (CML)
akutní myeloidní leukemie (AML)
akutní lymfoblastická leukemie (ALL)
CSCs byly jasně prokázány u AML a CML, a jsou s vysokou pravděpodobností i u ALL.
Díky tomu, je u těchto onemocnění onemocnění nedostatečné působení běžných
antiproliferativních farmak.
AML - IL3-R+ (není u normálních HSCs), CD33+ (IgSF, sialoadhesin)
- CD33 se zdá být vhodným pro rozpoznání AML CSCs (imunoterapie),
navíc byl prokázán u některých dalších leukemických CSCs.
- vysoká aktivita NF-B a PI3K u AML SCs, ale ne u HSCs, farmakologická
inhibice NF-B a PI3K nebo mTOR (target of rapamycin; substrát PI3K)
snižuje proliferaci AML SCs, ale ne HSCs (=>CSCs specifická terapie)
CML - charakteristický fůzní gen BCR-ABL (=> nadbytek ABL kinázy), inhibitory
ABL (imatinib mesylate, dasatinib) potlačují leukemii, ale ne její SCs,
=> vysazení vede k obnově onemocnění
Neurální CSC - NCSC
- neurální CSCs se připravují a vytvářejí/rostou podobně jako NSCs sférické plovoucí
útvary (= neurosféry)
- neurosféry mohou být rozsuspendovány na jednotlivé buňky, z nichž některé jsou
multipotentní a jsou schopné vytvořit novou neurosféru, případně dávat vznik všem
známým skupinám neurálních buněk (neurony + glie, stejné pro NSC i NCSC)
- NSCs i NCSCs exprimují povrchový antigen CD133 (AC133), u některých gliomů bylo
prokázáno, že pouze CD133+ buňky izolované z těchto nádorů jsou schopné tyto
nádory po transplantaci vyvolávat, kdežto ostatní buňky ze stejného nádoru ne,
a to ani v případě aplikace o 104 vyšší koncentrace buněk
- u NCSCs je také dobře prokázán vznik jak z NSCs, tak z neurálních prekurzorů
(TA buněk, pro které jsou známy dlouhodobé kultivační podmínky pro růst in vitro)
SC a CSC mléčných žlaz ­ MaSC a MaCSC (Mammary CSC)
- MaSCs ­> SP populace Sca1+ a liniově negativních (B220­, Gr-1­, Mac-1­, CD4­,
CD5­ a CD8­) buněk tvořících ,,mammosféry" (podobně jako neurosféry obsahují
jak SCs, tak množství progenitorů a diferencovanějších typů buněk)
- kmenové buňky mléčných žlaz jsou schopné dát vznik prsní tkání po transplantaci
do vhodného prostředí
- z metastázujících prsních nádorů byly izolovány buňky CD44+/CD24-, schopné tyto
nádory vyvolávat po následné transplantaci, oproti 100 násobnému množství ostatních
buněk izolovaných z takového nádoru
- pravděpodobně ne všechny CD44+/CD24- mají potenciál CSC
- CD44+/CD24- buňky nejsou také pravděpodobně odvozeny od MaSCs ale od TA
LT-LCR (long term label retaining cell)
ST-LRC (short term LRC)
ER ­ receptor pro estrogen
PR ­ receptor pro progeteron
CD24 ­ povrchový protein s GPI kotvou
CD44 (H-CAM)
Woodward, 2005
METAPLASIE (- TRANSDIFERENCIACE?!)
Potenciální možnosti:
1) Přímá přeměna fenotypu buňky jednoho typu v buňku typu jiného
- s proliferací (metaplasie)
- bez proliferace (pravá transdiferenciace)
2) Prvně směrem zpět v diferenciační řadě a následně diferenciace
do jiné diferenciační řady (rediferenciace a následně diferenciace).
Za pozorované jevy zřejmě ale odpovídají zbytkové populace progenitorů.
- s proliferací
- bez proliferace (silně nepravděpodobná existence)
Přístupy:
a) Vnějšími faktory
b) Exogenní expresí vhodných genů
c) Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky
(sem patří i terapeutické klonování)
d) Kombinací výše zmíněných postupů
metaplasie ­ přeměna kmenové nebo progenitorové buňky jednoho
typu tkáně v progenitor tkáně jiné
transdiferenciace ­ přeměna buňky jednoho typu na buňku typu jiného
bez průchodu buněčným cyklem
transdeterminace ­ metaplasie v průběhu embryogeneze
Rawlins & Hogan (2006) Development 133, 2455-2465
?
? ?
diferenciace
- změny v metylaci DNA / metylačním paternu (CpG a CpA oblasti)
tyto modifikace jsou relativně obtížně změnitelné
- změny v metylaci / acetylaci / fosforylaci histonů
- telomery / telomerázy
- změny v PcG proteinech
=> transkripce jiných genů = jiný fenotyp
??
? ?
?
?
SC / TA
diferencované
buňky
- málá a často sporná účinnost
- závislé na buněčném typu, často jen u SCs a TA buněk
- pokud je to možné, tak se většinou jedná o malou změnu / krok
(!není úplně jasné, jestli je potřeba rediferenciace!)
- uplatnitelnost in vitro spíše s některou z dalších metod a zejména pro
zachování získaného fenotypu re- / transdiferencovaných buněk
Příklady:
- exokrinní buňky pankreatu -> hepatocyty
- epitel hltanu -> střevní epitel (po poškození žaludečními kyselinami,
tzv. Barrettova metaplasie)
- progenitory glií ???
- pigmentové buňky oka (iris) -> buňky rohovky (u čolka)
- některé kultivační experimenty ukazují, že různé progentory / SCs
mohou nabývat fenotypu jiní diferenciační řady,
např SCs / TA epidermis x nervová tkáń
- B-lymfocyty mohou tvořit makrofágy
A. vnějšími faktory
- výrazně účinější než působení vnějších faktorů
- ,,vhodné" geny jsou zejména cytoplasmatické pro-onkogeny / onkogeny
a transkripční faktory
- epigenetická paměť buněk (zejména metylace DNA), ale zřejmě
nedovoluje úplnou změnu
Příklady:
- nadbytečná exprese RasRas a MycMyc indukuje částečnou rediferenciaci a transformaci
- exprese Pdx1Pdx1 (marker -buněk pankreatu) navozuje částečný fenotyp -buněk
u hepatocytu a střevních epiteliálních buněk
- exogení exprese cc--MycMyc, Klf4, Oct4 a Sox2, Klf4, Oct4 a Sox2 navozuje fenotyp ESCs
u embryonálních fibroblastů (myš)
B. exogenní exprese vhodných genů
C. Přeprogramováním jádra
cytoplasmou jiné buňky
buněčná fůze ­ spojení cytoplasmy a jader
dvou buněk za vzniku buňky
jediné
heterokaryon ­ produkt fůze buněk jasně
odlišitelnými dvěma nebo
i více jádry
hybridní buňka ­ vznikne když heterokaryon
projde mitózou za vzniku buňky
s jedním jádrem ale s více jak
2n DNA (nemusí obsahovat
kompletní jadernou DNA
původních buněk)
- závislost na momentálním stavu
buňky
- velice účinné, ale přenos jádra málo
úspěšný u savců
- fůze buněk je ale relativně běžná
Úplné reprogramování terminálně
diferencované buňky cytoplasmou
oocytu u žab (ale i savci).
Myš klonovaná z jádra
čichového nervu
BMSSCs exprimující -galaktosidásu
pod kontrolou svalově specifického
promotoru
Heterokaryon Purkiňova neuronu v mozečku
a GFP+-BMSSC
Regenerace samičích Fah -/letálních
jater (FAH ­ fumarylacetoacetate
hydroláza) transplantací
samčích HSCs
Detekce Y chromozomu v játrech
po transplantaci (dole) a FAH
aktivity vpravo nahoře.
Demetylace otcovského,
mateřského a reprogramovaného
(jaderný přenos)
genomu
Reprogramování jádra, methylace DNA a chyby v embryogenezi
Analýza exprese Oct4 mRNA u klonovaných
a kontrolních blastocyst (in situ hybridizace).
Účinek reprogramování jádra diferencované
buňky na expresi Oct4-GFP a schopnost
růstu ICM.
Vývoj klonů a IVF/ICSI embryí exprimujících
GFP in vitro.