Genotoxicita Testy na detekci mutací Genotoxicita • ...term that in a broad sense may refer to the property of a substance as being harmful to the genetic material (COM, 1898) • …any deleterious change in the genetic material regardless of mechanism by which the change is induced (D´Arcy and Harron, 1993) • …any agent which, by virtue of its physical or chemical properties, can induce or produce heritable changes in those parts of genetic apparatus that exercise homeostatic control over somatic cells, thereby determining their malignant transformation (Druckley, 1973) Genetická toxikologie • interdisciplinární obor vniklý v 70. letech minulého století • sleduje poškození DNA a jeho důsledky chemickými látkami přítomnými v životním prostředí • jsou používány metody genetické analýzy a tradiční toxikologické přístupy • sledují se zejména pozdní účinky chemických látek genetickými metodami Důsledky genetického poškození genotoxickými látkami Postup při stanovení rizika konkrétní chemické látky • hazard identification – identifikace rizika (např. identifikace látky s mutagenní aktivitou) 2. dose-response assessment – stanovení vztahu dávka-odpověď 3. exposure assessment – stanovení expozice – jak mnoho chemikálií je absorbováno ze všech zdrojů 4. risk characterization – charakterizace rizika – stanovení rizika určitého nepříznivého efektu (např. choroby) vyplývající z předchozích výsledků ve vztahu k jednotlivci či populaci Bezpečná prahová dávka Při hodnocení genetického rizika konkrétní látky je doporučován následující postup • A) detekce její mutagenní aktivity • B) studium metabolismu látky člověkem • C) stanovení množství látky, které bude působit na populaci a jednotlivce • D) riziko expozice testovanou látkou • E) nejvyšší přípustnou úroveň genetického poškození Identifikace mutagenní aktivity sloučeniny • informační zdroje • metoda SAR (structure-activity relationship) – počítačové modelování a simulace (např. reakce s DNA) • biologické testy mutagenity (asi 200 testů) Příklady databází obsahujících informace o genotoxických sloučeninách Informace o mutagenních/karcinogenních vlastnostech jednotlivých chemikálií (katalog Sigma) Testy mutagenity Přehled testů mutagenity Testy na detekci mutací - rozdělení • krátkodobé (screeningové) x dlouhodobé testy na savcích • testy na gametické x somatické mutace • testy prováděné in vitro x in vivo • testy na detekci genových, chromozomových, genomových mutací • testy na reparaci DNA Výpovědní hodnoty testů mutagenity Hodnocení mutagenity jednotlivých chemických látek – systém „baterií testů“ Příklad testovací baterie (Kanada) pro látky s omezeným použitím Monitorování prostředí - detekce environmentálních genotoxických látek A) laboratorní testy – odběr vzorku, testování (např. Amesův test …) B) monitorování in situ (sledování genetického poškození u populace vyskytující se v dané lokalitě – např. hlodavci, škeble, ryby, rostliny…) Příklady prokaryotických detekčních systémů Amesův test (Salmonella typhimurium) Plotnový test mutagenity podle Amese • bakteriální detekční systém indikátorových kmenů Salmonella typhimurium představuje nejvíce rozšířený přístup pro screeningové hodnocení mutagenního potenciálu jednotlivých genotoxických chemických látek a jejich komplexních směsí • je používán i pro hodnocení biotransformačních produktů chemických látek v tělních tekutinách (moč, krev) experimentálních zvířat a člověka • indikátorové bakteriální kmeny S. typhimurium His- auxotrofie ve vztahu k histidinu • existuje celá sada indikátorových bakteriálních kmenů umožňující detegovat specifický mechanismus působení testovaného mutagenního agens (substituce, posunové mutace a interkalační změny) • kromě mutace v histidinovém operonu mají kmeny mají další přidatné markery zvyšující citlivost k chemickým látkám: • mutace uvrB – vyřazení a blokáda syntézy enzymů excizní reparace • mutace rfa – zasahuje lipopolysacharidovou membránu bakteriálních buněk – zvyšuje se permeabilita povrchu bakteriálních buněk • přítomnost plazmidu kódujícího rezistenci k ampicilinu či tetracyklinu – zvyšuje citlivost k mutagenům Plotnový test mutagenity podle Amese Nejpoužívanější kmeny: • TA 98 – posunové mutace • TA100 - substituce Provedení: a) bez metabolické aktivace -S9 b) s metabolickou aktivací +S9 (homogenát z jater) Nutno provést vždy i negativní kontrolu (kontrolní rozmezí spontánních revertant) a pozitivní kontrolu (použití známých mutagenů) Příklady mutagenů používaných jako pozitivní kontrola u A. testu Příklad použití A. testu při testování mutagenity černouhelného dehtu (obsahuje hlavně PAU) SOS chromotest • univerzální bakteriální detekční systém umožňující hodnotit mutagenitu chemických látek vyvolávající taková poškození DNA nebo inhibici replikace, která v buňkách indukují SOS reparace • metoda je založena na biochemické anlýze indukovatelné b-galaktozidázy hodnocené kolorimetricky • test využívá specifického bakteriálního kmene Escherichia coli K12 PQ37, indukce SOS funkcí je hodnocena pomocí sfiA genu (patří do skupiny SOS genů) • exprese sfiA genu je monitorována prostřednictvím b-galaktozidázy (fúze sfiA genu s lacZ genem) Cytogenetická metoda = biomarker expozice genoxickým látkám Cytogenetická Analýza Periferních Lymfocytů = CAPL Materiál: lymphocyty periferní krve, G0 fáze, přetrvání 1000-1500 dní Kultivace: 48 hod, zpracování jako při karyotypování Barvení - konvenční metoda !!!! Hodnocení: počet aberantních bb. / 100 hodnocených mitóz Typy aberací: zlomy chromatidové a chromozomové acentrické fragmenty di- a tricentrické chromozomy kruhové chromozomy, výměny Hodnocení nálezů: ® 5% bez závěru (u jednotlivce), opakování=riziko rozdíly v hodnocení jednotlivců a skupin (2 % hranice u skupin) Párový fragment Kruhový chromozom Dicentrický chromozom Di- a tricentrický chromozom, difragment Dicentrický chromozom, difragment, kruhový chromozom Translokace Chromatidový zlom Chromatidový zlom Sesterské chromatidové výměny Mikrojaderný test Test na detekci přenosných translokací Použití FISH v genetické toxikologii Vyšetření spermií – testy na detekci abnormality tvaru spermie a detekce aneuploidie ve spermiích Testy mutagenity na Drosophila melanogaster • test na detekci somatických mutací a rekombinací (SMART) • detekce recesivně letálních na pohlaví vázaných mutací (Basc, ClB) Test na detekci somatických mutací a rekombinací (SMART)u Drosophila melanogaster Wing spot test Fenotypové projevy mutace mwh a flr SMART test SMART test - princip ClB test u Drosophila melanogaster Attached X test – Drosophila melanogaster Spot test u myší (somatické mutace) Spot test u myší (somatické mutace) Test na stanovení dominantních letálních mutací Detekce mutací – transgenní myši Testy na detekci genových mutací v savčích buňkách in vitro Materiál: buňky myšího lymfomu L5178Y a buňky čínského křečka línie V-79 Stanovení mutací v tymidinkinázovém lokusu TK Buňky deficientní v TK lokusu (TK-) vykazují rezistenci k pyrimidinovému analogu trifluorotyminu (TFT), neboť tento metabolit není inkorporován do DNA. V přítomnosti enzymu TK je však TFT zabudován do DNA – cytotoxicita Stanovení mutací v HPRT genu (hypoxantinfosforybosyltransferázový gen) HPRT gen (vázaný na X chromozom) kóduje enzym, který normálně fosforyluje guanin nebo hypoxantin. Této fosforylaci podléhá též 6-thioguanin (6TG), který se přeměňuje na 6 thioguaninmonofosfát (toxický). Detekce mutantních buněk – vytváří kolonie za přítomnosti 6TG Frekvence u zdravých lidí je asi 12,5 x 10^-6 Testy na mutagenitu u rostlin Rostlinné testy na detekci mutagenů Mullerův embryonalně letální test u Arabidopsis thaliana - test na detekci recesivních embryonálně letálních a chlorofylově defektních mutací - sledování embryí budoucí generace v nezralých semenech v šešulích rodičovských rostlin Tradescantia test – test na detekci somatických mutací • test je založený na výskytu somatických mutací v trichomech tyčinek květů klonu Tradescantia occidentalis, tento hybridní klon vznikl mezidruhovou hybridizací T. hirsutifloria (modrá barva květů) s a T. subacaulis (růžové květy) • po mutaci nebo deleci dominantní alely se fenotypově projeví recesivní alela pro růžové zbarvení • klon 4430 – citlivý k chem. mutagenům, • klon 02 – citlivý k účinku ionizujícího záření • Působení mutagenu na: řízky, poupata • každé květenství: 20 poupat, každý květ – 6 tyčinek, každá tyčinka – 50 trichomů • hodnotí se asi 10 květů • Vhodné pro testování herbicidů, fungicidů, insekticidů, exhaláty ovzduší, znečištění vody, půdy Tradescantia test Tradescantia test - mutace Příklady využití Tradescantia testu Vicia faba test Detekce chromozomových aberací v meristematických buňkách kořenových špiček Vicia faba Allium cepa – kořínkový test (možno detegovat chromozomální aberace, mikrojádra) Kometový test (comet assay) technika detegující poškození DNA a reparaci v individuálních buňkách Kometový test (SCGE – gelová elektroforéza jednotlivých buněk) • stanovení zlomů DNA nebo lézí vedoucích ke zlomům v jednotlivých buňkách (DSB, SSB) Princip: • izolace buněk (krev) • nanesení na mikroskopická skla s agarózou (2 vrstvy) • lze buněk (lyzační pufr, detergenty a soli o vysoké koncentraci) • dentaurace • elektroforéza – DNA migruje k anodě • barvení fluorescenčním barvivem • pozorování pod mikroskopem, měření délky komet (jader) • délka ohonu je úměrná počtu zlomů !!! Kometový test –parametry používané k hodnocení úrovně poškození DNA Příklad použití kometového testu