Osnova … trochu historie - savci pili alkoholický nektar miliony let - lidé vyráběli nápoje podobné dnešnímu pivu a vínu již před ~9000 roky (chleba před ~4000 lety) - poprvé kvasinky pozoroval A. van Leeuwenhoek v roce 1680 - název Zuckerpilz („cukerná houba“) tj. Saccharomyces od roku 1837 (T. Schwann) - L. Pasteur dokázal aktivní účast při kvašení (publikoval 1866, 1876) - první čisté kultury S. cerevisiae izolovány z piva (E.Ch.Hansen) a z vína (Muller-Thorgau) v 80.letech 19. století (cerevisiae = pivo v latině, pombe = pivo ve swahili) ... M. Rees popsal a pojmenoval S. ellipsoideus (fermentuje ovocné šťávy) - první systém pro klasifikaci (patogenních) kvasinek, založený na morfologii buněk a několika fyziologických testech (fermentace monosacharidů…) vytvořil A. Guilliermond v roce 1912 - … nejintenzivněji studovaná eukaryotní buňka … - první (S.c.) kompletně osekvenovaný eukaryontní genom v dubnu 1996 (S. pombe, 2002; v současnosti osekvenovaných >25 druhů kvasinek, + S.c. populační genomika => SNP polymorfismus) SGD databáze: http://www.yeastgenome.org/ Základní charakteristika kvasinek -Eukaryota – rostlinný systém – vyšší houby (1500 druhů) – rozdělení dle způsobu pohlavního rozmnožování (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) -Většinou jednobuněčné organismy (+ hyfy, + kolonie) -Nejčastěji kulaté a oválné (3-15 mikrometrů) -Množí se většinou pučením (+ jedině rod Schizosaccharomces: dělením - podlouhlé) -Zpracovávají zdroje uhlíku kvašením (vyjímky Lipomyces ...) Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny volná voda (nikoli chemicky vázanou) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (a[w]) a[w ]= poměr tlaku vodních par nad substrátem (potravinou) a tlaku par destilované vody – 0,95: Pseudomonas, Escherichia,…,většina bakterií – 0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) – 0,75: většina halofilních mikroorganismů – 0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) – 0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry Bakterie vyžadují vyšší hodnoty a[w ](víc dostupné vody)[ ]než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa … lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku – (a[w]=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) – rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), Lipomyces mají pouzdro – při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %), na 10 % NaCl[] Podmínky růstu - kyslík - Většina kvasinek je fakultativně anaerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů – ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) - fermentativní typy (S.c., S. p., rod Brettanomyces) - i v aerobních podmínkách fermentují (respirace i na glukoze představuje 10 % uhlíkového metabolismu) - respirativní typy (většina) – převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací - obligátorně aerobní – nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu - neprodukují ethanol) – rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis - teploty, při nichž mohou kvasinky růst: - mezofilní (0 – 48 °C) – většina druhů - psychrofilní (-2 – 20 °C) – voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus, Candida) - termofilní (ne méně než 20 °C) – potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyces) Maximální teploty, které některé kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. – rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny • Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulozu … nebo methanol, alkany apod.) • Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny Laboratorní podmínky: YPD – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa) SD – minimální (syntetické) médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) Přirozený výskyt - ve vodě (dle čistoty – moře 10/l, jezera 100/l, odpadní až 10^8/l; v arktických vodách Leucosporidium, v odpadních vodách Candida parapsilosis, S. exiguus, fekální znečištění indikuje Hansenula anomala, C. albicans, v olejem znečištěných vodách Candida (Yarrowia) lipolytica, C. tropicalis, v planktonu v závislosti na řasách např. Rhodotorula) - na listech rostlin, květech (červené kvasinky rodu Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, černá Aureobasidium pullulans) - na kazících se plodech … (zahnívající kaktusy => pektolytické bakterie => kvasinky Pichia cactophila, P. opuntiae => přenos a výživa drosofila) - přenášeny hmyzem (izolována Metschnikowia orientalis nalezena v květech a přenášena čmeláky na Cookových ostrovech, Int J Syst and Evol Microbiology, 2006) - v půdě (mnohem méně než bakterií, do 15cm hloubky – naproti tomu v Antarktidě jsou dominantní; podobné kmeny jako na listech či ovoci – Schwanniomyces, Lipomyces, Cryptococcus, schopny hydrolyticky štěpit cellobiosu, lignin nebo produkty bakteriálního metabolismu) Význam -praktický – - výroba piva, vína, etanolu a pekařského droždí (S.c.), různé kmeny pro spodní a svrchní kvašení, vinařské a lihovarské - krmná biomasa (Candida utilis), příprava mléčných výrobků (Candida kefyr, Klyuveromyces lactis), získávání ergosterolu (prekurzor vitaminu D), zdroj komplexu vitamínů skupiny B … - štěpení škrobu amylolytickými enzymy (Saccharmycopsis fibuligera, Schwanniomyces occidentalis) - štěpení dřevní hmoty (Aureobasidium, Candida utilis) -lékařský – 15 druhů je potenciálními lidskými patogeny (vyvolávají onemocnění u oslabeného organismu – imunosupresiva, cukrovka …- antibiotika na eukaryota nezabírají) – více prof. Svoboda -Kandidózy (C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C.glabrata, C. krusei, C. lipolytica) -Candida albicans – urogenitální a krevní infekce (vyskytuje se u člověka přirozeně) -Cryptococcus neoformans – 8% AIDS pacientů – plícní onemocnění až do mozku - (přenáší švábi a holubi – kreatinin z trusu používají jako zdroj dusíku) -Malassezia – poruchy pigmentace kůže tzv. pityriázy (lupy) -3 druhy Trichosporon (kúže) -výzkumný – S. cerevisiae a S.pombe jsou modelovými organismy -Rychle rostoucí eukaryontní buňka ... -Metody využívající kvasinek (2-H, FASAY) -Exprese proteinů (posttranslační modifikace, štěpení … hepatitis B core antigen) Morfologie kvasinek Morfologie kvasinek-hyfy Morfologie kvasinek-spory Identifikace kvasinek -Eukaryota – rostlinný systém – vyšší houby (Eumycota) - rozdělení dle způsobu pohlavního rozmnožování (asko-vřecko, basidio-stopkovýtrusé a deuteromycetes; basidiosporogenní produkují ureasu – na močovině s fenolčervení se barví červeně …) - dále dle morfologie, fermentace atd. (viz předchozí kriteria) - konvenční taxonomie je ovšem problematická : - morfologie kvasinek není stabilní→ různé varianty kvasinek náleží do jednoho rodu - Většinu fyziologických charakteristik lze zvrátit mutací v jediném genu - molekulární taxonomie (navíc pro komerční účely je třeba odlišit kmeny druhu S.c.) - karyotyp pomocí pulsní gelové elektroforézy, restrikční polymorfismus chromosomální nebo mitochondriální DNA, PCR analýza (nejčastěji PCR-RFLP = restriction fragment length polymorfism – 26S rDNA) - nejnověji MALDI-TOF Evoluce Studie populací S. cerevisiae a S. paradoxus • Sekvenace (hybridizace na čipech) > 100 kmenů z různých koutů světa • S. paradoxus – linie izolované podle lokalit • S.cerevisiae - 3-4 původní linie, které se díky člověku křížily …