Nepřímý test ELISA

Kompetitivní inhibice mezi antigeny. Reakce: Ag[1]  +  Ag[2] +  Ab + Ab[s]E


1.)  Nanést Ag[1] na celou destičku (př. B. afzelii) v optimální koncentraci  navázat, pak 2 kroky

2.)  50 μl kompetitoru Ag[2] (= inhibitor, např. B. garinii) o různé koncentraci: 500 pg/ml, 250
pg/ml, 125 pg/ml …. v řádcích A, B, C, ... 1 hodina kultivace

3.)  nanést 50 μl Ab (ve správném ředění dle předchozího pokusu) do všech jamek kromě sloupce 12,
kde bude blank

4.)  50 Ab[s] (sekundární protilátka proti Ab) v optimálním ředění (ve správném ředění dle
předchozího pokusu) též všude kromě blanku

 (pg = pikogram = 10^-12g)


Hodnocení:

A)   OD nebo B) %inhibice

Čím vyšší % inhibice (nižší OD), tím silnější druhý Ag a naopak: čím vyšší OD, tím silnější Ag na
destičce už navázaný. 100% se rovná určité absorbanci pozitivní kontroly, která znamená pozitivní
kontrolu, tj  u pacient nakažený B. afzelii a pacient nakažený B. garinii.


Grafem je jediná standardní kalibrační křivka o 8 bodech, každý z nich je průměrem z 11 bodů, jedná
se o výslednou křivku (opět logritmická škála). Do grafu vyneseme i křivku hodnot blanku.


Příklad (naměřené hodnoty absorbance zobrazeny pouze u blanku, z ostatních zobrazen pouze vypočtený
průměr):

Ag[2 ]¯


        1

                                                          2

                                                                                                   3

                                                                                                    4

                                                                                                     5

                                                                                                      6

                                                                                                       7

                                                                                                        8

                                                                                                         9

                                                                                                         10

                                                                                                           11

                                                                                                            blank

                                                                                                                průměr

500 pg

       A












                                                             0,108

                                                                  1,348

250 pg

       B












                                                             0,081

                                                                  0,966

125 pg

       C












                                                             0,057

                                                                  0,640

62,5 pg

       D












                                                             0,039

                                                                  0,360

31,2 pg

       E












                                                             0,027

                                                                  0,195

15,6 pg

       F












                                                             0,013

                                                                  0,120

7,8 pg

       G












                                                             0,007

                                                                  0,080

3,9 pg

       H












                                                             0,003

                                                                  0,072

      Na  osu Y patří absorbance nebo % inhibice.