Detekcia mutácií v ľudskom genóme Vladimír Ferák Katedra molekulárnej biológie Prírodovedecká fakulta Univerzita Komenského Bratislava i Detekcia mutácií v ľudskom genóme A. Identifikácia neznámych mutácií B. Detekcia známych mutácií (diagnostické metódy) A. Identifikácia neznámych mutácií Referenčná metóda: sekvenovanie Skríningové metódy založené na analýze: 1. homoduplexných NK: - DGGE (TGGE) - SSCP, REF 2. heteroduplexných NK: - HA (elektroforéza) -DHPLC 2 Detekcia mutácií v ľudskom genóme B. DIAGNOSTICKÉ METÓDY (cielená detekcia známych mutácií): - RA: reštrikčná analýza - ACRS: amplifikáciou utvorené reštrikčné miesto - ASO (SSO): alelovo špecifické oligonukleotidy - ARMS (ASA): alelovo špecifická amplifikácia - TaqMan (Real-time PCR) 3 DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Fischer a Lerman, 1979) Teoretické východisko; -väčšina DNA fragmentov sa skladá z 2 a viac denaturacných domén -stringencia denat. podmienok je funkciou sekvencie -mutácia (zmena sekvencie) môže viesť k zmene mobility v elfo -pri elfo vo t koncentrácii denaturantu rýchlosť migrácie fragmentov pri určitej koncentrácii prudko i (denaturácia 1. domény). Princíp: separácia fragmentov na základe rozielnych podmienok denaturácie Metodické prevedenie: 1. Získavanie DNA fragmentov: PCR, RŠ 2. Elektroforéza - gél: PAGE - denaturant: urea a formamid (100 % denaturant -7 M urea a 40% formamid) - detekcia: farbenie striebrom, hybridizácia 4 DGGE Double stranded DNA DNÁ MOLECULES ANNEAL IN DISCRETE DOMAINS Complete strand separation High melting domain Low melting domain Increasing temperature/chemical denaturant i 5 DGGE: charakteristika Charakteristika - dĺžka fragmentov 100-1000 bp - fragment musí obsahovať min. 2 denat. domény (neidentifikuje mutácie v doméne s najvyššou stringenciou denat.) - detekčná schopnosť je 50 - 70 % - "GC-clamp" - umelo priradená doména s vysokou stringenciou na 5'- koniec fragmentu: detekčná schopnosť cca 95% - nedáva informáciu o lokalizácii mutácie - TGGE - Temperature Gradient Gel Elpho - modifikácia DGGE (zvýšenie stringencie denaturácie pomocou zvyšovania teploty) SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism (Orita a spol., 1989) Teoretické východisko jednovláknová DNA za nedenaturačných podmienok vytvára terciárnu štruktúru, stabilizovanú vnutrovlaknovými interakciami mobilita ssDNA v nedenaturačnom PAGE je funkciou terciárnej štruktúry zámena báz (mutácia) môže viesť k zmene terciálnej štruktúry s následnou zmenou mobility Princíp separácia na základe rozdielnej terciálnej štruktúry ssDNA Metodické prevedenie Získavanie DNA fragmentov: PCR, RŠ Denaturácia fragmentov: teplota, formamid PAGE (nedenaturačný gél) 7 homozygot A SSCP heterozygot homozygot B 8 SSCP: Single-Strand Conformational Polymorphism • Charakteristika: - Dĺžka analyzovaných fragmentov: do 400 bp - Detekčná schopnosť: <100% • Fragmenty 200 bp: cca 80% • Fragmenty 300 bp: cca 60% • Dlhšie fragmenty: štiepiť RE - Neinformuje o lokalizácii mutácie -Veľmi jednoduchá, široko využívaná metóda - Občas používaná aj pri diagnostike g SSCP gél mutácia Primer F "~* -1= Exon2 Intron 1 Primer R -*----------- Intron 2 __ i„| ,jlH ^M — ^ammm* 10 SSCP v diagnostike A. Family 1002 B. Family 1006 SSCP v di agnostike Normal P121L M ulati on REF: Restriction Endonuclease Fingerprinting • Teoretické východisko: - ide o modifikáciu SSCP - analyzovaný fragment sa separátne štiepi 5-6 RE (získa sa 10-12 dsDNA obsahujúcich mutáciu - zmenená mobilita môže byť výsledkom: - zmenou sekundárnej štruktúry (SSCP komponent) - zmenou RM (RFLP komponent) • Metodické prevedenie: - PCR generujeme fragment - fragment separátne štiepime RE - zmiešame štiepne produkty - SSCP elfo (nedenat. PAGE gél) - detekčná schopnosť: veľmi vysoká; potrebujeme referenčnú vzorku (bez mutácie) 13 Metódy založené na analýze heteroduplexných NK heteroduplex - dvojvláknová NK, ktorá nevykazuje úplnú komplementaritu báz ^ M denaturácia I reanealing y homoduplexy mismatch heteroduplexy .. Heteroduplexová analýza • heteroduplexy majú zníženú pohyblivosť v nedenaturačných géloch • HA detekcia mutácie G152fs v HGO géne G152fs 15 DHPLC: Denaturing High-Performance Liquid Chromatography Oefnara Underhill 1998 Princíp: detekcia prítomnosti heteroduplexov na základe ich kratšej retencie na chromatografickom nosiči za čiastočne denaturačných podmienok • nosič je pozitívne nabitý; DNA negatívne • retencia dsDNA je funkciou elektrostatickej interakcie (retencia je závislá na dĺžke fragmentu) • interakcia heteroduplexov je menej stabilná ako homoduplexov • parciálna denaturácia heteroduplexov spôsobuje významný posun v ich retencii na nosiči 16 DHPLC-po/cr. Charakteristika DHPLC • dĺžka fragmentov do 1,5 kb • senzibilita a špecifita > 95 % • detegovateľné mutácie: substitúcie, inzercie a delécie • rýchlosť: 3-5 min. na jeden fragment • získanie fragmentov: bežná PCR reakcia • odhalí prítomnosť mismatchu > samotnú mutáciu treba určiť sekvenovaním 17 DHPLC -pokr. • parciálna denaturácia sa dá dosiahnuť teplotou (táto teplota sa dá stanoviť výpočtom na základe sekvencie fragmentu alebo empiricky) • typickým obrazom DHPLC sú 4 piky (2 pre homoduplexy a 2 pre heteroduplexy) DHPLC ... čo potrebujeme: ale nemáme ... 19 Diagnostické metódy RA: Restriction Analysis • Teoretické východisko: - RE sú vysoko špecifické - mutácia: a) vytvorí nové RM b) eliminuje existujúce RM - CpG dinukleotidy: mutačný „hot spot" (prednostne využívame RE s CpG v cieľovej sekvencii) • Metodický prístup: - Southernova hybridizácia - PCR • Charakteristika: - dĺžka fragmentov: pri SH neobmedzná, pri PCR limitovaná PCR - detekčná schopnosť pod 50% - používa sa aj ako diagnostická metóda (bežná, historicky prvá) 20 ACRS: Amplification Created Restriction Site Rozširuje RA na prípady, keď mutácia nevytvorí ani neeliminuje RM • Princíp: pomocou PCR zavedieme do nemutovanej alely RM, ktoré je prípadnou mutáciou eliminované • Metodický postup: - PCR s jedným upraveným primerom - reštrikčné štiepenie - elektroforéza - vizualizácia 21 ACRS: detekcia mutácií v géne HGO IVS5+1G->A l£__ V300G 200bp^- <- 200bp R58fs 22 ASO: Allele Specific Oligonucleotides SSO: Sequence Specific Oligonucleotides Princíp: pre každý oligonukleotid sa dajú určiť podmienky denaturácie, pri ktorých len úplná komplementarita zabezpečuje stabilitu dvojvláknovej štruktúry. Metodický postup: - PCR testovaného úseku - dot/slot blot hybridizácia na membráne • analýza jednej mutácie - zakotvenie testovaného fragmentu • analýza viac mutácií - zakotvenie panelu oligonukleotidov 23 ARMS: Amplification Refractory Mutation System ASA: Allele Specific Amplification • Princíp: mismatch PCR primeru na 3'konci znemožňuje PCR • Metodické prevedenie: - 3 primery: • 1 spec, pre normálnu alelu (N) - forward primer • 1 spec, pre mutovanú alelu (M)-forward primer • 1 spoločný (S) - reverse primer • plus pár primerov pre kontrolnú PCR reakciu - 2 PCR reakcie: NN NM MM • 1.PCRS-N + + • 2. PCR S-M + + 24 ARMS-PCR: princíp Forward N ---------------C ------------------------G --------------------------------------------------------------------- ----------------c-------------------------------^— Reverse S Forward M ---------------T ------------------------A --------------------------------------------------------------------- ------------------------T ----------------------------------------------^------ Reverse S ARMS primery M + S N + S | PCR produkty: MM + - PCR produkty: MN + + PCR produkty: NN - + Vyšetrenie 2. exónu génu GJB2 na mutáciu R127H pomocou ARMS-PCR Ladder M N M N M N Ladder CP produkt ARMS produkt- Genotyp: 500bp 400bp NN MN MM 26 ARMS: 12 3 4 5 MNMNMN MNMN NN NN NN MN NN 13 14 15 16 17 MNMNMNMNMN MN NN NN NN NN populačná štúdia 6 7 8 9 10 11 12 MNMNMN MNMN M N M N !•*■ -- MN MM NN MN MN MN MN 18 19 20 21 22 23 MNMNMNMNMNMN * MN NN NN MN NN NN TacjMan (Real-time PCR) TaqMan špecifická sonda: „reporter" a „quencher" DNA polymeráza pri PCR sondu odbúrava: reportér svieti TaqMan sonda im l-lll H l*IM I9|l I •! lŕ denaturácia .........."■'-...........fcifc±Ji II LililJLll±eľJ annealing * polymerizácia TaqMan: priebeh 5 '-Primer ©___š> 5' © 3' 5' _© 3' 5' 3'-Primer © 3' 5' TaqMan 7700 Perspektíva: sekvenovanie - aj ako diagnostická, aj ako skríningová metóda DNA SEQ. LAB KTCCAATCCCCAATGGTd 0 90 I163J 584J , 880l 960, 1 31 Celera's sequencing center in Rockville, MD. 32