Molekulárna genetika človeka Metódy identifikácie a izolácie ľudských génov Vladimír Ferák i Metódy identifikácie a izolácie nových génov • Funkčné klonovanie („priama genetika") - protein —► AA sekvencia —► oligosondy —► skríning knižníc - protein —> protilátka —> imunoprecipitacia na polyzómoch - protein —► protilátka —► skríning cDNA knižníc • Pozičné klonovanie („obrátená genetika") - určenie pozície génu na chromozóme - kráčanie po chromozóme - konštrukcia kontigu - hľadanie klonov s kódujúcimi sekvenciami - identifikácia klonu s hľadaným génom - klonovanie hľadaného génu, jeho charakterizovanie - overenie (pacienti) • Kandidátne gény - vyhľadávanie v databázach (bioinformatický prístup) - využitie zvieracieho modelu (myš) 2 Funkčné klonovanie („priama genetika") • Východisko: génový produkt (protein) alebo protilátka k nemu • Štandardný postup: - sekvencia AA proteinu - preklad z AA do sekvencie DNA (pozor: degenerácia kódu!) - syntéza degenerovaných DNA oligo-sond - skríning cDNA knižníc - pozitívne klony použiť ako sondy pri skríningu genómovej knižnice - pozitívne klony v DNA knižnici: overiť na pacientoch • Iná možnosť: imunoprecipitácia na polyzómoch - na polyzómoch: mRNA a Polypeptid na jednom mieste - historicky úspešná (1980-90), už sa však nepoužíva 3 Funkčné klonovanie: príprava DNA oligo- sond AA sekvencia: ..- Ala - Glu - Val - Val - Ser - Ala -... . . .GCA GAA GUA GUA AGC GCA . . .GCC GAG GUC GUC AGU GCC .. .GCG GUG GUG UCA GCG . . .GCU GUU GUU UCC GCU UCG UCU 4 x x x x 6x4 = 3072 x degen. oligo (zmiešané sondy) 6 - 7 AA-^ 18 - 21 bp-* postačujúca špecifickosť Sondami skrínujeme cDNA knižnice (z tkanív, kde sa gén exprimuje) testovanie na genómovej knižnici (cDNA ako sondy) 4 cDNA kniž. požit, klony cDNA Príklad génu identifikovaného funkčným klonovaním: gén pre faktor F8 - hemofília A (Gitschieretal. 1984) purifikácia F8 z krvi terapeutický F8 DNA-diagnostika sekvenovanie proteinu (15 AA) degenerované oligo-sondy (45 bp) expresia v bunkách mutácie cDNA kontig (9kb) gén (186 kb, 26 E) skríning cDNA knižníc cDNA klony I__/ skríning g-knižnice Pozičné klonovanie: určenie lokalizácie génu • Chromozómové prestavby (delécie, translokácie) - hľadať pacientov s monogénnym ochorením a s chrom, deléciou (občas súčasne viac monogénnych ochorení u jedného pacienta) - monogénne ochorenie plus chrom, translokácia - metóda klonovania deletovaného génu: subtraktívna hybridizácia • Strata heterozygotnosti (LOH) pri TSG - len pri hľadaní tumor-supresívnych génov - porovnávať STR v DNA z nádoru a z norm, tkaniva (tí istí pacienti) - hľadať STR v ktorom v DNA z nádoru nastala LOH • Väzba s lokalizovanými polymorfizmami - zhromaždiť väzbovo-informatívne rodiny stanoviť lod-skóre s jednotlivými STR (prípadne VNTR alebo SNP) - nájsť tesne viazané STR (VNTR, SNP) pred aj za génom - „chromosome walking" medzi týmito STR: zostaviť kontig (knižnicu usporiadaných klonov) 6 Klonovanie DNA fragmentov z chromozómovej delécie: „subtraktívna hybridizácia" Normálna DNA: štiepená RE (napr. Mbo\) - klonovateľné fragmenty DNA pacienta s deléciou: fragment, mechanicky (ultrazvuk) - neklonovateľné ▼ ▼____s_ _s____s__s_ A. J.___Y_ } Mbo\ - málo DNA A —*-------Y-------* del -*--------------Y------ Y______Y___________Y___ __________Y______I_I_________Y A. i_ i A. A. A___i. i___i__i____i. ultrazvuk - nadbytok DNA denaturácia DNA abnorm. - abnorm: neklonovateľné ^ / abnorm. - norm: neklonovateľné reasociácia —► norm. - norm: klonovateľné! Príklad: CGD, DMD a XRRP u pacienta „BB." s deléciou na X-chromozóme: klonovanie všetkých troch génov v r. 1986 Subchromozomálna lokalizácia pomocou hybridných buniek s chrom, deléciami 5 ^^^^^^^^^ŕ^T^ 153 14 14 15 11.2i HMFAP3 MFAP3: mikrofibrilárny protein HMFAP3 PCR product + 8 Hlavné kroky pozičného klonovania väzba s STR ■rrO ŕí [ n f Ľhr* m lokalizácia BAC kontig kandidát, gény mutácia Gin C TSTOP genet, mapovanie fyzické mapovanie skrining génov skrining mutácií 9 Hľadanie viazaných STR: väzbová analýza a & o o 5 O 3 \\2 H 4 I 5 III3 511-3 elhi * Ills Z o SbBk D7SSG0 2 D7ŮS3U 3 DTS334 4 D7S7flff B D?Sf73ŕ 4 r*. 3 3 4 4 51 4 B * * 3II3 3 II3 3 II9 9 IIs 9ltta »IIa z||ss 2 lie a II» í IIa ill? «I U 2 3 a * r a 1 1 ■Mill 4 4 9 9 I-2 * I* * 1 t I 1i f l|| 11 k t r 10 1 U* 3 J .DrSTQU D7S813 multipoint tod 3 score zhromaždiť väzbovo-informatívne rodiny typizovat' STR markery so známou lokalizáciou pre každý marker vypočítať lod-skore lod-skore >3,0 -► väzba —► poznáme lokalizáciu map position (cM) 10 Grafické znázornenie lod-skóre Konvenčné hodnoty lod-skóre: > 3 ... dôkaz väzby < -2 ... dôkaz neprítomnosti väzby 11 Autozygótne mapovanie AA Aa Aa aa 2 Aa O Aa Ô Aa O AA Inbredný homozygot aa IV/1 zdedí od spoločného predka svojich rodičov I/2 spolu s alelou a aj alely tesne viazaných polymorfizmov: je pre ne homozygot („autozygot") 12 Autozygotné mapovanie: rodokmeň z genetického izolátu (Rómovia) s AR ochorením (RP) n—,—o O—i-Ú O-r-D b—.—O O-r-D 3 S O—i—D O—,—□ ■Ů-r-O <3*J* d^d ó tfTř-^r d^-4* ó á Ti &5-0 ^ Autozygotné mapovanie s polymorfným markerom D14S63. Všetci pacienti (na obrázku vľavo) nesú jednu alelu v homozygotnom stave v porovnaní s ich zdravými príbuznými (vpravo), u ktorých je v rôznych genotypoch zastúpených celkovo 6 rôznych aliel. 15 Kontig: súbor prekrývajúcich sa klonov z genómovej knižnice Vektory: YAC - yeast artificial chromosomes BAC - bacterial artificial chromosomes YAC4 YAC 2 YAC3 YAC1 E C J. B D kontig 16 YAC: yeast artificial chromosome AfiSl TRPl CEN4 Amp* OIL TEL tftfrtíHI Sim\ Cloning site Sßl. NúA UJtAÍ AJířřHIh S>italt Phosphatase TRPÍ ARM C EN J Restriction fragment CEN - centroméra ARS - oh TEL - teloméra URA, TRP-selekč. markery Inzerty 100-700 kb transformácia buniek S. cerevisiae i selekcia i klony, knižnica i kontig 17 BAC: bacterial artificial chromosome BAC vectors can accommodate DNA fragments up to 300 kb BAC vectors are similar to standard E coli plasmid vectors - Contain the origin and genes encoding the ORI-binding proteins required for plasmid replication derived from a naturally occurring large plasmid, the F- fac tor Low copy number (1-2 copies per cell) Low transformation efficiency overcome by electroporating recombinant DNA into E. coft Advantages of BACs compared to YACs - Stable Ease of transformation Speed of growth of £ co/i host Simpler to purify More user-friendly ."■■;■■'■ I HfridMI WoM 18 Chromosome walking dve genómové knižnice, K1 a K2, každá získaná iným RE: M1 smer „kráčania" „kráčanie po chromozóme" knižnica 1 knižnica 2 gén M2 ---------------- ■— chrom. DNA 19 55 Chromosome walkina": kráčanie do chromozóme ORNL-DWG 9iM-i7370 LINKED FLANKING MARKER LINKED FLANKING MARKER DISEASE GENE fc^y^d Probe from 5' flan king rn~ mariner is LB_ used ti identity an overlapping frag ment fro m a genome library GENOMIC DMA. FRAGMENT PROBE Probes from the 3 "ends of cloned fragments are used to identity successive overlapping cloned fragnnents G hronrtisonne walking continues until aclone is identified that contains the 3' flan king marker Konštrukcia kontigu \ kontig klonov od L ku M BAC (alebo YAC) Kontig prúžku 8q23 (20 cM) 9Ü0E1 1 776A10 770B12 765D12 694F2 673E8 O—O- 773E12 704D8 16A7S16E8 746A1 O -O- o-o-o—o 975F5 513C8 236G8 807E10 —ooo— o-o oooooo -c—o- 940D10 A124C6 893G6 759C1 -OOO---------- o o-o-o —oo---- 7Ö4E10 623B6A11A1Ü —O------------ O— í 33ÍÍÍ o m m m o >D 2 2 n — O — O :ŕO O -J O -J ^ -J m m m m m m m c_ o o -J KJ ro ro -j > -ti X X X X x x e*j -J -J u CO CO "T 1 CO Nj ro ro CO ZS oo —i —i Oo CO Oo 00 £ CO 4i - -t W ^í? > ro > w ^w o o o o o o o CO CO Oo — 4i ^Co en Oo 0o Oo en ^^D I =3 =3 =3 =3 =3 =3 CD C? Oo Cd o "^ ro o n o en > — en — — ro ro UD 4i OJ X OJ en^1 x ro Q. Co ro o CD ^2 x -^ O - w ho w _____ o en o ji • o OJ ~' -.i CO # microsatellite marker — RFLP s exon, EST, or cDNA probe E223 genomic DNA probe or STS 0 100 200 300 400 500 kb posledné „kroky": F. Collins et al., 1989 29 CFTR gén, jeho produkt, mutácie a CF CA*-. 2E/-.3. *---------& ^a4l-5H!----B iťiWl I-----H B? IO 11 12 12 L4t>lG17al8 1* «5 « ^=í íl 2-4 Tra n sc ription Primary transcript mRNA CFTR protein NHj RÍMA processing ----------------------------- (A)n é/39 »^t/e^TÍ^«* Tra nslation ATT» binding sites #Fol irťU ding and insertion into membrane CI-TR too channel through membrane CFTR protein Lipid bil aye r r" of cell membrane J smembrane ATP binding sites ľC:&lor:£ Hydrophobic transmembrane domains ATP tjin-difii domain. h^- ■ ~ ln.-fram Nonsei Fraitia Spiicin e cd e letia n se mutation ise mutation -shift mutation C mutation Exons or CF gene 1 Z 3 -4 5 e-* 6b 7 B 3 IQ 11 12 '■i i■ť~:Ľr[-^i^|,m \--i--—^t~ t r._„i—.i.^l-------1 Regulatory domain _ ial4bl51 Kal4bl516 17al7bl& 19 2QZ122 23 a-* -^t^^J.. - L „I..1 ■ í 7.1 -------. Mutations Prvých 10 rokov pozičného klonovania (vybrané ochorenia) rok ochorenie lokalizácia gén chrom, abnorm 1986 Duchenne sval.dystr. Xp21.3 DMD delX(p21.3) retinoblastóm 13q14 RB del(13)(q13.1-q14.5) 1989 cystická fibróza 7q31.2 CFTR žiadna 1990 neurofibromatóza 17q11.2 NF1 translokácie 17 Wilmsov tumor 11p13 WT1 del(11)(p14p13) 1991 fam. polyposis coli 5q21 APC del(5)(q15q22) syndróm frag. X Xq27.3 FMR1 frag i Iné miesto myotonická dystrofia 19q13.3 DMPK žiadna 1993 Hutingtonova chorea 4p16 HD žiadna tuberózna skleróza 16p13 TSC2 žiadna 1994 achondroplázia 4p16 RGFR3 žiadna karcinom prsníka 17q21 BRCA1 žiadna 1995 spinálna sval. dystrofia 5q13 SMN1 žiadna 31 Skríning kandidátnych génov väzba s STR ■rrO ŕí [ n f Ľhr* 5* lokalizácia BAC kontig kandidát, gény mutácia Gin C TSTOP genet, mapovanie hľadanie v databázach skríning génov skríning mutácií 32