JŕWWSttfc, ^»UNkHi* KOMPLEXNÍ choroby ä i fell! 12.11.2007 Geny a onemocnění Monogenní nemoci Komplexní nemoci Huntingtonova ch. Spinocerebelární ataxie Tuberózní skleróza Alzheimerova nemoc Kardiovaskulární choroby Autismus Parkinsonova nemoc Nemoci vyvolané zev, faktory Influenza • Hepatitída Spalničky - Prostředí -Geny Genetika onemocnění s komplexní dědičností ■ ' Dědičnost se podílí na většině běžných onemocnění U téměř 2 ze tří jedinců způsobuje během života morbiditu a předčasnou mortalitu nemoci, jako jsou IM, rakovina, duševní choroby, diabetes apod. Frekvence různých typů dědičných onemocnění Typ dědičnosti Incidence při porodu (na 1000) Prevalence ve veku 25 let (na 1000) Prevalence v populaci (na 1000) Onemocnení způsobená genomovýnru a chromozómovými mutacemi 6 1,8 3.8 Onemocněni způsobená mutacemi jednoho genu 10 3,6 20 Onemocnení s multrfaktoriálnl dědičností -50 -50 ~ 600 Údaje upraveny a převzaty 7 Rimnin DL. Connor JM. Fyeritz RE. F.mcry and Rimoin's Principles and Practice or Medical Genetics 3. vyd., ChurchiH Livingstont! IW7, Edinburgh ■' • Dědičný znak nebo postižení, které buďto je nebo není přítomno => diskrétní (kvalitativní) znak • Měřitelné vlastnosti (fyziologické nebo biochemické veličiny -TK, výška, hladina cholesterolu, BMI) => kvantitativní znaky Pochopení dědičné podstaty variability kvantitativních znaků je základem pro porozumění tomu, jak se geny podílejí na vzniku komplexních nemocí. ■' Problémy, kterými se budeme zabývat Jak zjistit, zda určité geny přispívají ke vzniku častých nemocí a k variabilitě v kvantitativních fyziologických znacích Popíšeme metody studia těchto chorob Vysvětlíme metody, které se používají k určení, kolik genů se na vzniku určitého fenotypu podílí a metody, jimiž je zjišťována lokalizace těchto genů v genomu Nakonec si ukážeme řadu příkladů komplexních nemocí ■' Komplexní nemoci CFTR gen Mutace Cystická fibróza Komplexní choroba Faktor 1 zevního prostredí ■*- -k Faktor 2 zevního prostředí Pohlaví Věk Spektrum lidských chorob ■ ' Single gene A Mehdetjan Reduced penetrance Genetic / \ iultifactoriat with single major locus ktorial Polvoenic Environmental • Geneticky dominantní Neúplně penetrants \ \ Polygenní v Faktory zevního prostředí Zevní prostředí Bomprezi et al. 2003 40 (a) Multilocus/multiallele hypothesis (Senes A B C D F F G Alleles Hl J K L. Alleles Genes A B C D... Common disease/common variant hypothesis (b) Polygenes Oligogenes Major genes ^=1.1 GB.C ■' Komplexní nemocí (znaky) Stojí na vrcholu pomyslné pyramidy složitosti celé genetiky Genotypovou složkou komplexních chorob není striktní determinizmus, nýbrž predispozice k fenotypové manifestaci nemoci Rada interakcí: genotyp - genotyp genotyp - prostředí Epidemiologickou charakteristikou komplexních chorob je statistická kumulace v rodinách, tj. statisticky významně zvýšená frekvence onemocnění u pokrevních příbuzných daného postiženého jedince bez jasného mendelistického způsobu přenosu ■' Polygenní model • Základy genetiky komplexních stavů položil v r. 1918 R.A. Fisher (A) One focus (B) Two loci 110 120 (C) Three loci AAbb AaBti aaBB Aabb aaBb i AABb AaBB 1 aabb AABB 130 AaBBCC 70 s of affected girls Affected boys only Affected children o- either Affected brothers Affected sibs of either sex Affected brolhers Affected sibs of either sex ■' Dnešní model - se od těch klasických v několika ohledech dost zásadně liší > Je jasné, že genotypova složka komplexních znaků není tak rozsáhlá, jak se předpokládalo (nezahrnuje stovky, max. desítky genů) > Genotypova složka není homogenní ve smyslu rozsahu účinku jednotlivých genů (zahrnuje geny jak relativně velkého, tak i malého a středního účinku) > Vzájemný vztah jednotlivých predisponujících genů není v žádném případě uniformně aditivní u vyjádřeno multiplikativním modelem => souhrnný účinek predisponuj ících genů je roven součinu jejich dílčích účinků (interekční efekty) ■' Podklady pro hledání genetické determinace: > Zvýšený výskyt v rodinách > Zvýšená incidence u dvojčat: MZ > DZ > Dědičnost intermediárních fenotypu: Familiární výskyt nemocí Familiární agregace Je charakteristikou nemocí s komplexní dědičností, protože příbuzní sdílejí větší podíl genů navzájem mezi sebou než s nepříbuznými osobami Obráceně to platit nemusí - FA neznamená, že se na chorobě musí podílet dědičnost => rodina nesdílí jenom stejné geny, ale i vnější prostředí, kulturní návyky, vzorce chování apod. ■ ■ Nutno posoudit podíl genetických a negenetických faktorů ■' Konkordance a diskordance Mají-li 2 příbuzní jedinci v rodině stejnou nemoc - konkordantní Je-li jeden postižený a druhý ne - diskordantní => lze vysvětlit jiným vlivem dalších faktorů nutných k nastartování patologického procesu Naopak - konkordantní fenotyp může vzniknout i při rozdílných predisponujících genotypech => nemoc u jednoho z nich je genokopií nebo fenokopií druhého Konkordance a sdílení alel mezi příbuznými ■ ■ Čím blíže jsou si 2 rodinní příslušníci, tím více alel zděděných od společných předků mají totožných Pokud geny přispívají ke vzniku onemocnění významně, stoupá konkordance pro dané onemocnění s rostoucím stupněm příbuznosti - extrémní případ: MZ dvojčata - příbuzní 1. řádu: rodič + dítě (společná 1 alela s každým z rodičů) pár sourozenců vč. fraternálních (DZ) (25% má stejnou dvojici alel nebo žádnou alelu, 50% má stejnou 1 alelu) s každým lokusem je tedy průměrný počet mezi sourozenci sdílených alel 0,25 (2 alely) + 0.5 (1 alela) + 0.25 (alel) = 1 alela • Pokud tedy geny k nemoci predisponují, lze očekávat, že X, bude nejvyšší pro MZ dvojčata, nižší pro příbuzné 1. stupně a dále klesá úměrně počtu sdílených alel ■■ Vztah k probandovi Podíl s probandem sdílených alel Monozygotics dvojčata 1 Příbuzní prvního stupne 1/2 Príbuzní druhého stupně 1/4 Příbuzní třetího stupně 1/8 ■' Podíl relativního rizika (A,r) vyjadřuje, kolikrát vyšší pravděpodobnosti onemocnění čelí definovaný příbuzný nemocného jedince ve srovnání s obecným rizikem populace l = prevalence nemoci u příbuzných „r" postižené osoby prevalence nemoci v populaci r - znamená obecně příbuzný („relative"), v praxi se měří např. Xs („sibs"), A,p („parents") ■' Podíly relativního rizika X r příbuzných probandi! s vybraným onemocněním Čím vyšší je hodnota X, tím větší je familiární agregace a tím snazší je genetická analýza daného komplexního znaku. Hodnota A, r= 1 znamená, že příbuzný nemá větší pravděpodobnost vzniku nemoci než kterýkoliv jedinec v populaci Onemocnení V*t»h r Schi/olrenie MZ dvojčata Sourozenci 48 12 1 Autismus M2 dvojčata Sourozenci 2000 150 Mamo-depresivnl (bipoiámi) porucha MZ dvojčata Sourozenci eo 7 Diabetes mellitus 1. typu MZ dvojčata Sourozenci SO 12 Crohnova choroba M Z dvojčata Sourozenci 840 25 Roztroubená skleróza MZ dvojčata Sourozenci ------------------------------------------------------------------------------------■ e 00 24 MZ = monozyjEotická Údaje upraveny a převzaty z Rimoin DL Connor JM. Pyeritz RE. Emery and Rimom's Principles and Practice of Medical Genetics, 3. vyd., Edinburgh, Churchill Livingstone 19*7; a King RA, Rotter J L Motulsky AG. The Genetic Basis or Common Diseases Oxford, England, Oxford University Press 1992. ■' Studie dvojčat „experiment přírody na lidech" Základním přístupem je tradičně stanovení stupně fenotypove shody u MZ a DZ dvojčat -» minimalizace relat. vlivů zevního prostředí čím vyšší je fenotypova shoda MZ oproti DZ dvojčatům, tím vyšší je relativní genetický příspěvek studovaného komplexního znaku Výhody: umožňují abstrahovat od variability prostředí ■' Porovnání konkordance u MZ a DZ dvojčat Vyšší konkordance u MZ dvojčat oproti DZ dvojčatům je silným argumentem pro přítomnost genetických faktorů (zejména u onemocnění s časným výskytem) Onemocnění Konkordance (%) MZ DZ Netraumatická epilepsie 70 6 Roztroušená skleróza 17,8 2 Diabetes mellitus 1. typu 40 4,8 Schizofrenie 53 15 Osteoartróza 32 16 Revmatoidní artritída 12,3 3,5 Psoriáza 72 15 Rozštěp rtu s/bez rozštěpu patra 30 5 Systémový lupus erythematodes 22 0 Údaje převzaty a upraveny z Rimoin DL, Connor JM, Pyeritz RE Emery and Rimoin's Principles and Practice of Medical Genetics, 3. vyd., Edinburgh, Churchill Livingstone 1997; a King RA, Rotter JI, Motulsky AG The Genetic Basis of Common Diseases. Oxford, England, Oxford University Press 1992; Tsuang MT. Recent advances in genetic research on schizophrenia. J Biomed Sei 1998;5:28-30. ■' Omezení studií dvojčat MZ dvojčata i přes totožný genotyp nemají stejnou genovou expresi (např. náhodná X-inaktivace u žen) Ve skupinách lymfocytu se MZ budou lišit díky somatickým chromozomálním přestavbám v lokusech pro Ig a T-buněčný receptor Nitroděložní prostředí nemusí být pro obě stejné Expozice faktorům zevního prostředí nemusí být stejná (zejména u chorob s pozdní manifestací) Posun zjištění - 1 postižené dvojče přivede 2. (volunter based ascertainment = zjištění na základě dobrovolnosti) místo toho, aby byla nejprve zjištěna jako dvojčata a pak vyšetřena (population based ascertainment) ■' Heritabilita (h2) Je definována jako relativní podíl variability podmíněné geneticky na celkové variabilitě znaku h2 = VG/Vp [Variabilita fenotypu (Vp) = genetická variabilita (VG) + variabilita zevních faktorů (VE) ] • čím je vyšší a blíží se jedné, tím vyšší je obecný příspěvek genetické složky ve fenotypu Nejjednoduší způsob odhadu dědivosti (heritability) znaku je => dvojnásobek rozdílu korelačního koeficientu MZ a DZ dvojčat ■' Odhad heritability ze studií dvojčat Rozptyl hodnot fyziologických měření u množiny párů MZ dvojčat (100% genů) je porovnán s rozptylem hodnot měření u dvojic DZ dvojčat (50% genů) rozptyl u DZ dvojčat - rozptyl u MZ dvojčat rozptyl u DZ dvojčat Je-li variabilita znaku určena zejména prostředím, je rozptyl u DZ dvojčat blízký rozptylu u MZ a čitatel a tím i hodnota h2se bude blížit 0. Pokud je variabilita dána pouze genetickým složením, rozptyl u MZ dvojčat je nulový a h2 je rovno 1. Heritabilita běžných komplexních nemocí (znaků) Astma 60% Krevní tlak 40-70% Kostní denzita 60-80% Degenerace plotenek 60-80% IDDM 70% Obezita 50-90% Osteoartritida 50-70% Revmatoidní artritída 60% Ulcerativní kolitida 50% Vztah mezi incidencí v populaci a incidencí u příbuzných postižených osob i oooo 1OO0 As 100 10 Mendelian recessive 1 OOOO IOOO PoDulation incidence too ■' Genetická analýza komplexních chorob Důležité je definovat studovaný fenotyp Komplexní choroby (astma, cukrovka) konglomerát fenotypu nižších úrovní Intermediární fenotypy - např. hladiny IgE, bronchiálni hyperreaktivita u astmatu Vágní stanovení fenotypu komplikace při porovnávání různých nezávislých studií ■' Genetická analýza komplexních nemocí má vždy statistický charakter zdědění jednotlivé patologické alely není ani nezbytné, ani dostatečné pro manifestaci komplexního fenotypu Zevní faktory Genet, faktory + Geny + zevní faktor} Dosud se nepodařilo charakterizovat žádnou komplexní polygenní chorobu ve formě úplného souboru „patologických" alel a jejich interakcí (navzájem a se zevními faktory) ■' Hledání genů Mendelistických a komplexních chorob 100 90 80 m m c 70 & GO I K 1 50 1 S 40 30 i i 20 * 10 0 ■' Molekulární základ komplexních nemocí u člověka Formal Trait Gtne Molecular basi» i m 11 ^H ■ oompL mentation? Hmůfr Type 1 datot4s M^DQ5 Aspartic acid at position 57 is protective No Type 1 dafrtqs HU-ÜQA MuÜIpta amino acid substitutions No Type 2 dafrtfls OSN 10 Intronic haphtype No Crohn's dinan CAROIS* MuUipto amino acid substitutions, singh nudsotide insertion at nudaoBda position 3O20 causing frameshift and prot4h truncation No Ahhaimers dis»» Apc£ Arginhí substituted for cyshha at position 11ľ No Asthma ADW33 Coding and noncoding haplotype pain No Angiotensin 1- ACE MultipU Irtrapnfc SNF: Ho ooroertíng gnzOTH Iflvflls Metodologie genetického výzkumu komplexních nemocí Model dědičnosti Komplexní ir ir Hledání kandidátních genů Na základě hypotéz Celogenomový screening Bez hypotéz ^ ' ^' t ľ Poziční Funkční Vazba Mikroarray ^ ^ Dle modelu dědičnosti Bez nutnosti modelu ■ i " Rozsáhlá oblast chromozomu Kandidátní geny ^ \ r Rodinné studie Populační studie —i ► Funkční analýzy <— Modifikováno dle Wills-Karp M and Ewart SL Nature Review 2004 Allelic architecture and mapping strategy u (D ! O CD £ D-rO í D-rO 1 Family-based linkage studies Unlikely to exist Association studies in populations Ü D D O DD O oo0° o D 0 o D O Frequency in population Metodologie genetického mapování komplexních znaků (nemocí) > Studie na modelových organizmech > Vazebné studie - parametrické \ neparametrické TDT analýza > Asociační studie - retrospektivní („case-kontrol") \ prospektivní Celogenomova analýza x studium jednoho (několika) polymorfizmu Vazebné studie (linkage studies) parametrické neparametrické ■' Klasická vazebná analýza v rodinách A/l %K Sdílení alel (např. sib pair metod) VC o A/A Identity by state M ■A/l ■A/C o n n ve Identity by descent ■' LOD skóre Statistická metoda vyhodnocující genetické markery v rodinách s cílem určit, zda jsou 2 lokusy vázány. Lod skóre je logaritmus šance (odds), že tato vazba existuje. Konvenčně je LOD skóre 3 (šance 1000:1 ve prospěch existence vazby) přijímáno jako důkaz vazby a lod skóre -(minus) 2 (100:1 proti) jako důkaz, že lokusy nejsou vázány. LOD Score Analysis The likelihood ratio as defined by Morton (1955): L(pedigree|9 = x) L(pedigree | 9 = 0.50) where 6 represents the recombination fraction and where 0 < x < 0.49. When all meioses are "scorable", the LR is constructed as: (0R(l-0)NR) L.R.= (0 = o.5f z(0) is the lod score at a particular value of the recombination fraction The LOD score (z) is the log10 (L.R.) : z(0) is the maximum lod score, which occurs at the MLE of the recombination fraction TDT analýza (transmision disequilibrium test) n rodin přenesena alela *1 » Al /A3 nepřenesena alela S3 Bomprezzi et al. 2003 u D O ■ O Asociační studie o o D • n _i • zdravé kontroly "n^cní pacienti Analýza kandidátních genů Pacienti Kontroly 5/20 5/20 Gen není důležitý Analýza kandidátních genů Pacienti Kontroly 10/20 5/20 Gen může být důležitý ■' Rodinné a asociační studie - dva konce kontinua 100 Association study -SS - Search for shared segments Homozygosity mapping first and second cousins Three-generation families: lod score Median length of shared segment Sib-pair study ■' Asociace je principem zcela odlišná od vazby Linkage (vazba) - je vztah mezi lokusy Asociace -je statistický údaj o společném výskytu alel či fenotypu (vztah mezi alelami či fenotypy) jí Alela A je asociována s chorobou D, když osoby, které trpí D mají A více (nebo méně často) než lze předpokládat z výskytu frekvencí D a A v populaci. !!! Problematika výběru kontrolní skupiny!!! Možné příčiny „pozitivní" asociace • Kauzální souvislost • Přirozená selekce • Populační stratifikace • Statistický artefakt IHodnoty pravděpodobností asociačních studií musí být korigovány: ne p=0.05 (event. 0.01) ale p=0.05/n (Bonferonni correction) ■ ' Linkage disequilibrium **Uttl«& • Posun zjištění (ascertainment bias) -tj. rozdíl v pravděpodobnosti, s jakou budou nahlášeni postižení příbuzní pacientů ve srovnání s postiženými příbuznými kontrol • Posun hlášení (recall bias) - větší motivace příbuzných probanda k vyplnění dotazníku, protože je jim dané onemocnění bližší Problematika studia komplexních nemocí Polygennost —» více faktorů - tzv. „malé" faktory ■' ■' Heterogenita (klinického fenotypu - genetická - populační) Allelic heterogeneity Locus heterogeneity PhenocQpy Definici Diagram When two ormore alleles af a singl? Iücus are independently associated with ihr same trait AJtelic variant i AIIsIk; variant« oNocusA of locus A When two or mare DNA variations in distinct genetic luci are independently associated with the same trait Allelic- variant i AJIalic variant li of focus A of locus B \ í Diss ass X Disease X The presence of a disease phenctype that has a nun-genefc {rundum c* environmental! basis Allelic variant i Enviromigntal of locus A tactorK \ / DiseasaX Trait heterogeneity Phänotypic variability Definition When a trait, or disease, has been defined with insufficient specificity such that itisactualh/twu or mure distinct underlying traits Diagram JTgt{\ Trait II / DteasasX Variation in the degree, severity or age of onset of symptoms exhibited by persons why actually have the same trait tir disease process Symptom A Symptom B / \ Moderate ůf aewpe Early on sed or late onset R-ssenigtJon 1 of trait I Presentation 2 of trait I \ ■' Interakce faktorů Gene-gene interaction Gene-environment interaction Definition Diagram When hvů úľ more DNA variations interact either directly ÍDNA-DNA or DNA-mRNA interactions!, to Charty trart-scription or translation levels, or indirectly by way of their protein products, tu alter disease risk šepote from their independent effects of locus A of locus B T* No disease When a DNA variation interacts with an environmental factor, such Ihsl their combined effect i S distinct f rum their independent effects of locus A tór K Nydisearo Dis™ X 10209439 287�49 Genokopie Genotyp determinující velmi podobný fenotyp determinovaný odlišným genotypem Fenokopie Fenotyp, který je obvykle podmíněn specifickým genotypem, je u fenokopie podmíněn interakcí nějakého faktoru zevního prostředí s normálním fen oty p em Inkompletní penetrance zděděné příslušné sady patologických alel ještě nemusí nutně vést ke klinicky manifestnímu onemocnění Pleiotropie Mnohočetné fenotypové efekty jednoho genu nebo jednoho páru genů Impriting modifikace maternálních a paternálních genů během gametogeneze tak, že mají odlišnou expresi v zygote (fenomén odlišné exprese alel v závislosti na rodičovském příspěvku) ■' Genetická analýza komplexních nemocí vs. monogenních chorob Gen Nalezení „variant" v příslušném genu Analýza genových variant ■ Mendelistické nemoci Komplexní nemoci Diagnostika i ___ Léčebná Prognostický Genetické intervence indikátor poradenství „Náchylnost" (susceptibility) I 1 Klinický význam dosud „problematický" Vyjádření „rizika" u komplexních nemocí ■ ■ Riziko = pravděpodobnost vývoje onemocnění Numericky: 0-1 Znaky (genetické, environmentálni,...), které zvyšují tuto pravděpodobnost => rizikové faktory: Výsledky různých studií daného RF by měly být konzistentní Asociace by měla být silná a specifická (nezávislá na jiných faktorech) Odpověď dávka/efekt Biologická věrohodnost Síla asociace ■ ' Síla asociace je vyjádřena podílem nadějí (odds ratio) vypočítaným z frekvence dané alely u pacientů a kontrol on = A/C B.'D AD BC (11 KS) = $.71 Je-li frekvence studované alely shodná u pacientů i kontrol, je podíl nadějí = 1 Condilior: Total Ves Ne 1 n 41 11 » WĚĚM ■ 5 C 9 14 CiD m 45 20 ffi A-B+C+D • Jinou, ale podobnou mírou asociace je vyjádření relativního rizika (RR), které porovnává riziko vzniku nemoci při nosičství určité alely s rizikem bez nosičství této alely RR = */*+B = W&H-ITPfl) = 1 45 C/C+D {107ŮH7G74} • U vzácných onemocnění se přibližně rovná i podílu nadějí (b < d a a < c) ■ ■ Condition: Total íes Mo Expwt Yes 349 (A} 1437 (B) 17B8 N& 17« C 6SM 0 T^7^ C+D Total 1425 9335 A+e+C+D ■' Alergické choroby - příklad komplexních chorob Celosvětově řazeny mezi závažnou skupinu civilizačních nemocí - komplexní nemoci „Alergie" - z řečtiny (alios ergeia) = změněná schopnost reakce (von Pirquet,1906) „anafylaktická reakce" - už z r. 2140 př. n. 1. (faraón Menes po bodnutím hmyzem) Alergie = imunopatologický stav neúčelné obrany organismu, vyjádřen nepřiměřenou specifickou odpovědí na antigenní podnět navozující zánětlivé změny ve tkáních a vedoucí k poruše funkce orgánů GENY PROSTREDI Alergeny Viry Polutanty Mírné ATOPIE BHR * ASTMA GENY PROSTŘEDÍ Závažné Genetika astmatu 2006 ÉĎ-f^ _^ -^ »U W- H C O) 1 1 O Q. £t>. ý* 1 r- ^ ---J ^ 10 *i 1 1- 10 * P 2-5 É-lQ Počet studií s pozitivními asociacemi CHIA (0) COX2 (1) VCAM1 (0) AGT(1) CLCA1 (0) HMNT(3) DAP (3) STAT4 (1) SELP (0) CCR3 (2) CHRM3 (0) TLR9 (3) ST2 (0) IL8 (1) ICOS (0) EDNRA (1) IL8RA (0) UGRP1 (3) MUC7 (0) EDN1 (1) PGDS (0) IKAP (2) IL15 (0) FLAP (2) IRF2 (0) MCP1 (3) IRF1 (0) IFNGR2 (1) IL3 (0) IL13RA1 (1) CYFIP2 (0) SDF1 (0) C3AR1 (0) PTGER2 (0) AACT (0) IL12RB1 (0) SSCE (0) TIMP1 (0) CXCR3 (0) KCNS33 NAT2 ACP1 DEFB1 IL1RN TLR4 IL1A C5 IL1B GATA3 DPP10 ALOX5 CCR5 CRTH2 IL5RA IL18 TLR6 AICDA TLR10 VDR TLR2 IFNG CSF2 PHF11 IL5 CYSLTR2 IL12B TCRA/D TIM1 CMA1 TM3 PTGDR HLA-G CARD 15 HLA-DQA1 NOS2A HLA-DPB1 CRHR1 TAP1 CCL11 PAF AH TBX21 EDN1 STAT3 IFNGR1 ITGB3 CCL24 ACE CCL26 C3 CFTR GSTT1 NOS3 MIF GSTM1 IL10 CTLA4 SPINK5 LTC4S LTA GRPA NOD1 CC16 GSTP1 STAT6 NOS1 CCL5 TBXA2R TGFB1 -10 IL4 IL13 CD14 ADRB2 HLA-DRB1 HLA-DQB1 TNF FCER1B IL4RA ADAM33 Modifikováno dle Ober C a Hoffjan S Genes Immun 2006, ■' Celogenomové analýzy u alergických nemocí dosud 12 celogenomových studií (http://cooke.qsf.de/asthmaqen) Detekce oblastí chromozomů s možnou vazbou na výskyt alergických chorob nebo intermediárních znaků (IgE, eosinofily, kožní testy apod.) celogenomová signifikance - vzácná, většinou „podezřelé" oblasti některé výsledky se opakují, některé rozdílné (jiná populace, jiná metoda, jinak definovaný fenotyp) Oblasti chromozomů „podezřelé" z účasti na genetice astmatu ■ ■ Cytogenetický Iokus lp3l 2p ľq33 3p 3q2l Iq24q27 4q35 •f L' 5q3l q33 6p23p2l 7plSp14 7q35 9q3l 11 pí S 11pl3 11 q13 I2ql5q24 I3q2l I3q3l Hqll 1Bp12 lĚq22q24 I7pl2-1?q11 l7q1Z-2l 1Sq13 2lq2l Xq28 IYcĚS) Atopie Alergické astma Celkové IgE Chromozom 1 f B i! EIS H g I M^UII E( uja Chromozom 3 zndj ííäi Hl I Hl I [\[[ ííí i |!| UtE e * & Haagerup et al. 2002 Astma a další alergické nemoci Eichenfield et al. 2003 Gen pro ADAM33 (A Disintegrin And Metalloproteinase 33) ■■ první gen asociovaný s astmatem a BHR nalezený na základě celogenomové vazebné analýzy (Eerdewegh et al. 2002) exprese: fíbroblasty a hladká svalovina broncho funkce: - zinek-dependentní metaloproteináza, zakotvená v plazmatické membráně - mj. interakce s membránově vázanými enzymy a receptory, extracelulární komunikace - účast v remodelaci dýchacích cest u astmatu gen: chromozom 20pl3 Genom e-wide screen — Asthma — Asthma and BHR — Asthma and specific IgE — Asthma and total IgF. Candidate gene and SNP ^ identification ^Chromosome £0p13 2.5-Mb region containing dO genes, including ADAM33 and flanking GFfV\4 and SN Association studios O Expression ADAM33 SNPs tested by TDT and haplotype analysis Analysis of various tissues richjdinij whole ^Lmg and five different pnmary lung cell types Wills-Karp M and Ewart SL Nature Review 2004. 5: 376-387 TABLE IL Asthma-related phenotypes associated with SNPs in AD4JWJ3 Population Phenotyp» SI \u\ 82 ST+4 ST+7 T1|M-*T) TZ Ml V-1 V4 Dutch Positive ST Total serum IgE /*=.037+ P=.OI4t P =.046* P=.050* African American Positive ST ŕ=.022* h m Total serum IgE US while Posilive ST Toial serum IgE 1»=.031* P=.0033* P=.0037* US Hispanic Posilive ST Total serum IgE P=.032* P-.,m P=.0092* p-..m 57] Skin lesL 'Common allele it itctssive. tCodoiniiuiit model i tComraon allele is i hwi.iiii Gen pro DPP10 (DiPptidyl Peptidase 10) Allen et al (2003) - vazebnou analýzou na chromozomu 2q Potvrzení TDT analýzou 144 rodin Sekvenování oblasti o 1,5 MB -> 105 SNP nejsilnější asociace s WTC122 nejběžnější alela asociována s astmatem a fenotypy (také haplotypy s touto alelou) Case-control studie 1047 dětí z Mnichova asociace s prick testy, atopií a astmatem ■ ■ Funkce: - modulace zánětlivého procesu v dýchacích cestách ? - regulace neuronální (parasymatická ganglia) ? Gen pro PHF11 ( Plant Homodomain (PHD) Finger protein-11) • Cookson et al. (2003) identifikovali PHF11 na chromozomu 13q podobným přístupem jako u DPP10 • 49 SNP, 4 del/ins a (GGGC) repetice -> 3 (intron 5, 9 a 3'oblast) associace s Ln IgE a astmatem • Funkce: - negativní regulace transkripce ? Gen pro Tim 1 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecules) Gen pro C5 (complement factor 5 gene) o1 (C3HVHeJ X AJ)F1 I A, (F1 x AJ> backcroas mice Positional :;nkí .tile yiinííí-: fefined by microarray Connection < with a OS * mutation 1 Ohromosome 2 A/J 5' CTGCA CTTTGA 3 IVo asthma I f MHOU I TCR O Allergen peptide T~> CSctR Wills-Karp M and Ewart SL Nature Review 2004, 5: 376-387 Oxid dusnatý a NOS L-Arginin L-Citrulin Epitel Agonista Ca2+ Agonista Ca2+ NO ŤCGMP a K„ kanál Cel otevřený Kontrakce i Relaxace Cytokiny Transkripce Modifikováno dle Gen pro NOS1 Glutamat Extracelulárně WKHtiWHtiWH-fflttHIWIW ytoplazma IMli C ytoplazma cGMP regulace Neurotransmise CA repeat (exon 29) CA repeat (exon 29) 3391 C/T + 5266C/T AAT repeat (intron 20) AAT repeat (intron 20) 5266C/T GT repeat v intron u 2 5266C/T AAT repeat (intron 20) s AB (Grasseman et al., 1999) s AB (Grasseman et al., 2000) s počtem eozinofilu s IgE (Immervoll et al., 2001) s FEN0 (Grasseman et al., 2001) s atopií (Ali etal., 2001) s IgE (Holla LI et al., Allergy 2004) s AB (Shao et al., 2004) s IgE s IgE (Leung et al., 2005) NOS1 deficientní myši mají nižší „upregulaci" NOS2 po LPS (nižší počty eozinofilu, nižší FeN0- lijima et al., 2005) Gen pro NOS2 Promotor I -2447 C/G i -1026 G/T 2219 C/G -2544 G/A V____y -1156 ins T -1491 G/A -718 A/C -963 A/G -21 C/T -277 A/G T (CCTTT)n -2.5 microsatellite -1659 C/T -1173 C/T -954 C/G (TTTA)n -0.7 repeat -247 C/T -2.5 kb (CCTTT)n repeat (Konno et al., 2001) s atopií a AB a +231 C/T v exonu 10 (Asp346Asp) (Grasemann et al., 2000) s atopií -1659C/T, -0.7 rep, -277A/G - pozitivita na peří a Ser608Leu (exon 16) - závažnost astmatu (12 vs. 41%, p = 0.0005; OR=5.00, 95% CI: 1.88-13.33) -2447C/-1659C/-1026G/-0.7del/-277A/Ser608 haplotyp - protektivní pro AB (Holla LI et al., Clin Exp Allergy 2006) Gen pro N0S3 40A/Ö Zůrdtsk transkripce Mil HIM 1 III Hill I III promtůtor InnrrľrW lrtroil3flM)n VNTR v intronu 4 s AB (Lee et al., 2000) VNTR v intronu 4 s IgE + pozitivitou kožních testů (Holla LI et al., CEA 2002) VNTR v intronu 4 s terapií u respir. alergií alela4rep: 8.9% vs. 31.6% (Schuller et al., Allergy 2002) VNTR v intonu 4 s AB (Yanamandra et al., 2005) Promotor -HWT-A •í:;ca ' 'TOTC|0 začátek 1 j. (■ transkr Lpce 1 5.0-10.0 Hem oc hrom atos is H/e H63D 002-0 22 4.0 NIDDM PPARy PI 2 A 0.85 nové poznatky by měly napomoci upřesnění diagnostických a/nebo léčebných postupů (individualizovaný přístup k terapii) Perspektivy výzk Komplexní nemoci = komplexní asociace Mela Haplotyp Gen li Komplex genů Interakce genů a prostředí Epigenetické efekty 9999999 Jak důležité jsou genetické vlivy u nejčastějších forem multigenních nemocí? Jaký je vliv prostředí na vznik nemoci? Které jsou nejslibnější přístupy k determinaci genetických faktorů pro nemoc? Které geny již byly vybrány jako možní kandidáti? Které cesty přispívají ke genetické vnímavosti pro danou nemoc? Jak mnoho genů se podílí na vnímavosti k nemoci? Jsou nejčastější formy multigenní nemoci asociovány s častou nebo vzácnou genetickou variabilitou v populaci? (hypotéza častá variace/častá nemoc vs. genetický heterogenní model)? Proč alely, které jsou asociovány s nemocí, nebyly z populace eliminovány? Jak důležité jsou pro danou nemoc interakce geny-prostředí a geny-geny? Jaké jsou důsledky pro farmakogenetiku? 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Disease Gene Discovery In Complex Disease 1. Define Phenotype a. Consistency b. Accuracy 1 2. Define the Genetic Component a. Twin Studies b. Adoption Studies c. Family Studies d. Heritability e. Segregation Analysis \ 3. Define Experimental Design ^~ 1 4. Ascertain Families a. Case-Control b. Singleton c. Sib Pairs d. Affected Relative Pairs i 5. Collect Data a. Family Histories b. Clinical Results c. Risk Factors d. DNA Samples ^ ^ \ r 6. Perform Genotype Generation a. Genomic Screen b. Candidate Gene ^ L. ^ 1 7. Analyze data a. Model-dependent b. Model-independent c. Association studies L Lod score sib-pair, relative pair case-control, family-based A *— ^ i 8. Identify, Test, and Localize Regions of Interest i 9. Bioinformatics and Gene Identification i , 10. Identify Susceptibility Variation(s) ^ i 11. Define Interactions a. Gene-Gene b. Gene-Environment The Genome Sequence is not THE answer! SOMf^Hr Děkuji Vám za pozornost