1
Molekulární patologie
Doc. MUDr. Kateřina Kaňková, PhD.
Ústav patologické fyziologie LF MU
UKB ­ Kamenice 5 ­ bud. A18
mail: kankov@med.muni.cz
2
Program
I. část:
­ definice a vymezení
molekulární patologie
­ funkční klasifikace
mutací
­ rozdělení a
charakteristika efektů
mutací
II. část ­ příklady:
­ diagnostický a
terapeutický přínos
molekulární patologie
diabetes mellitus typu 1
­ prediktivní význam
molekulární patologie
pro stanovení prognózy
a plánování léčby
familiární
hypercholesterolemie
3
Definice patologie
studuje etiopatogenezi
nemocí
­ etiologie = příčina vzniku
nemoci (vyvolávající činitel)
­ patogeneze = soubor dějů
provázejících vývoj nemoci
soubor morfologických a
funkčních změn, které nelze
striktně oddělit (pat.
anatomie vs. fyziologie)
v klasickém pojetí rovněž
diagnostický obor
zabývající se diagnostikou
nemocí a příčin úmrtí na
makro- a mikroskopické
úrovni
­ na úrovni organismu, orgánů,
tkání a buněk
4
Metody klasické patologie
pitva ­ inspekce
nekropsie (post
mortem)
biopsie (in vivo)
­ (imuno)histochemie
­ mikroskopie
světelná
elektronová
fluorescenční
5
Metody molekulární patologie
objasnění proč a jakým
mechanismem vede změna
sekvence DNA, RNA či proteinu
ke konkrétním patologickým
projevům
­ změna většinou získaná, v
somatických bb. nebo vrozené
u tzv. komplexních nemocí
diagnostika na molekulární
úrovni
­ nukleové kyseliny
­ proteiny
cytogenetika, FISH
PCR + RFLP, heteroduplexy,
SSCP, DGGE, sekvenování
microarrays
hybridizace
RNA/real time PCR
klonovani, transfekce,
mutageneze
izolace, separace proteinů,
blotting, ......
detekce apoptózy - DNA
fragmentation TUNEL, ......
6
Lékařská genetika
obor zabývající se převážně
monogenními, vrozenými
nemocemi
­ mendelistická dědičnost
autozomální
recesivní
dominantní
kodominantní
gonozomální
­ tzv. geny velkého účinku
1 gen = 1 nemoc
ale např. CF >500 mutací,
LDL receptor >700 mutací
náplň oboru:
­ patogeneze
­ diagnostika a predikce
­ poradenství
­ screening
7
Diag. využití mol. patologie
Onkologie
­ detekce zbytkové choroby po chemoterapii (MRD) a relapsu
­ zpřesnění klasifikace tumorů
chromosomální translokace (RT-PCR detekce bcr-abl mRNA,
t(9;22)
mutace onkogenů, supresorových a reparačních genů
­ mozaicismus po allogenní BMT
Hematologie
­ koagulopatie (poruchy kr. srážení)
hemofilie, von Willebrandova choróba, ...
­ familiarní trombofilie
Factor V Leiden, protrombin 20210A, C677T MTHFR,
­ anemie/přetížení železem
hereditární hemochromatóza
Mikrobiologie
­ detekce virů
EBV, CMV, HIV, HVB, C, ......
­ detekce bakteriálních patogenů
Helicobacter pylori, Mycoplasma tuberculosis, ...
Metabolismus, diabetologie a kardiologie
­ identifikace rizikových markerů nemocí
I/D ACE, HLA DB, DQ, MTHFR, apo(a), apoB, LDL receptor, ..........
­ identifikace genet. faktorů ovlivňujících efekty faktorů
prostředí a diety (= nutrigenetika)
MTHFR, ......
­ identifikace genet. faktorů ovlivňujících efekt léčby (=
farmakogenetika)
cytochrom P450 (CYP2D6, ........)
Forenzní patologie
­ DNA fingerprinting
­ DNA profiling
­ paternita 8
Klasifikace mutací
(A) strukturní = podle mechanizmu vzniku
­ délkové
delece (1bp ­ MB)
inzerce + duplikace
inverze
translokace
­ bodové mutace a SNP
silent (žádný efekt)
missense (záměna AK)
nonsense (stop kodon)
splice site (exon/intron splicing site)
(B) poziční = podle pozice v genu (lokalizace
mutace vs. efekt)
­ 5' UTR (tj. promotor genu)
kvantitativní efekt (např. různá intenzita transkripce)
­ exony
kvalitativní efekt (např. různá sekundární a terciární
struktura, aktivita, afinita, ...)
­ introny
kvalitativní efekt (změna sestřihového místa)
kvantitativní efekt ? (vazba represorů nebo enhancerů)
­ 3' UTR
efekt na stabilitu mRNA
(C) funkční
­ ztráta funkce (loss-of-function)
produkt genu je v důsledku mutace nefunkční či je jeho
funkce nedostatečná
­ získání nové funkce (gain-of-function)
produkt genu má v důsledku mutace abnormální funkci
­ gene dosage effect
odstupňovaný efekt podle množství produktu
9
Funkční klasifikace mutací
(1) "loss-of-function" mutace - recesivní fenotyp
­ 50% množství produktu stačí
­ většina vrozených chorob metabolismu
nemocní/přenašeči
celá řada DNA změn může vést k loss-of-function efektu
­ delece celého genu nebo části genu
­ porušení struktury bodovou mutací (missense resp. non-synonymní
mutace)
­ translokace, inverze nebo inzerce do genu
­ porucha transkripce
promotorová mutace snižující mRNA
pokles stability mRNA
­ frameshift mutace
inaktivace místa sestřihu nebo vytvoření alternativního místa sestřihu
nebo nonsense mutace
­ porucha posttranslační modifikace
­ porucha celulární lokalizace
­ porucha parenterálního imprintingu a metylace
10
Funkční klasifikace mutací
(2) "gain-of-function" mutace
­ změna DNA, která vede k vytvoření nějaké nové kvality
­ dominantní fenotyp
typicky během maligní transformace (mutace onkogenů vs.
supresorů)
­ dominantně negativní
nejen ztráta funkce produktu jedné alely, ale navíc blokáda
funkce produktu normální alely
mechanismy vzniku "gain-of-function" efektu
­ změna afinity k substrátu, popř. vazba jiného substrátu
­ overexprese genu
­ receptor není degradován, trvale obsazen
­ iontový kanál neustále otevřen
­ expanze trinukleotidového repeatu (CAG)n
­ strukturální abnormalita multimerických proteinů
­ vznik chimerického genu
­ neznámý
11
Funkční klasifikace mutací
(3) "gene dosage" mutace
­ týká se většinou genů, jejichž produkty:
jsou součástí signálních nebo metabolických kaskád
soutěží s jinými během embryonálního vývoje a v metabolismu
fungují ve stochiometrickém poměru s jinými
na X-chromozom vázané nemoci
­ např. hemofilie
muži nemocní / ženy přenašečky (ale!!!)
inaktivace jednoho z páru X-chrom. vede k růzě vyjádřenému onem. i žen
chromozmální numerické aberace
­ polyploidie
triploidie (69 XXX, XXY, XYY) - cca 2% všech početí, časný potrat
­ aneuploidie
gonozomální
XXX, XXY, XYY - normální očekávaná délka života, poruchy fertility
45, X - 99% letální, jinak poruchy fertility a fyzické změny
autozomální
nulisomie (chybění páru chromozomů) - preimplantačně letální
monosomie (chybění 1 chromozomu) - embryonalně letální
trisomie (1 chromozom navíc) - až na výjimky většinou embryonálně či
fetálně letální
 trisomie 13 (Patauův syndrom) - časné poporodní úmrtí
 trisomie 18 (Edwardův syndrom) - časné poporodní úmrtí
 trisomie 21 (Downův syndrom) ­ dožití cca 40 let
12
Využití mol. patologie k pochopení
etiopatogeneze nemocí
Příklady
­ (A) diabetes mellitus
(příklad 1) typ 1 (T1DM) ~5%
(příklad 2) maturity-onset diabetes of the young
(MODY) ~1%
typ 2 (T2DM) ~90%
­ (B) primární hyperlipoproteinemie
(příklad 3) familiární hypercholesterolemie
13
(A) T1DM ­ příklad 1
v důsledku autoimunitní destrukce
-bb. LO u geneticky disponovaných
jedinců
­ 30 - 50% konkordance u MZT
­ 15% u DZT
cytotoxická autoimunita (Th1)
zprostředkovaná T-lymfocyty vede
k postupné destrukci až úplnému
chybění -bb. a tím produkce
inzulinu
spouštěcí faktory autoimunity ­
časová a geografická variabilita!!!
­ virová infekce
zarděnky, spalničky, coxsackie B,
CMV, EBV, enteroviry, retroviry)
­ zevní faktory
proteiny kravského mléka - příliš brzy!
nedostatek vitaminu D (severojižní gradient)
sev. Evropa >>> prevalenci než jižní ­ slunce??
toxiny (dieta, voda, bakterie)
dynamika
­ manifestace obvykle v dětství, ve většině případů
autoimunita dokončena, absolutní závislost na
exogenním inzulinu
14
Genetika T1DM
IDDM1 (HLA II lokus, 6p21)
­ asociace je výsledkem mnohočetných
vazebných studií
­ hlavní rizikové determinanty (alely)
u bělochů jsou DRB1 a DQB1 geny
DRB1*04_DQ8
DRB1*03_DQ2
cca 10% je non DRB1*04/DRB1*03
jiné HLA II haplotypy
­ DQ6 antigen (DQA1*0102 a DQB1*0602) má silný
protektivní efekt
nejsilnější riziko nese genotyp DRB1*04_DQ8/
DRB1*03_DQ2
heterozygotnost pro jednu z výše uvedených alel v
kombinaci s jinými představuje menší riziko
jakýkoliv genotyp obsahující DQ6 má dominantně
protektivní efekt
molekulární podstata asociace
­ rizikové a protektivní varianty HLA II mění 3-D strukturu
povrchového antigenu (krystalografie)
antigen-binding cleft
­ rozdíly v selektivitě prezentovaných peptidů (APC) a
stabilitě komplexů antigen/molekula HLA II
­ protektivní molekuly mají stabilnější vazbu antigenu
­ hypotézy
nedostatečná delece autoreaktivních T v thymu
rozdílná vazna na TCR a tím rozdílná imunomodulace T-lymf.
(proliferující × regulační)
15
HLA II molekuly ­ prezentace
antigenu - imunotolerance
16
Genetika T1DM
IDDM2 (INS lokus, 11p15)
­ asociace je výsledkem vazebných studií
­ minisatelit (VNTR) v 5'UTR
repetice 14-15bp:
alela 1 (26 ­ 63 repetic) - riziková
alela 2 (64 ­ 139 repetic)
alela 3 (140 ­ 210 repetic) ­ protekční (AD)
­ asociace není tak jednoznačná jako u HLA
II
náznaky paternální transmise (maternální
imprinting)
molekulární podstata asociace
­ insulin jako autoantigen
riziková varianta vede k nižší expresi
genu a tím navození menší
imunotolerance???
17
Etiopatogeneze T1DM
18
(A) MODY (Maturity-onset
diabetes of the young) ­ příklad 2
cca 1% všech diabetiků v populaci
­ skupina monogenních diabetů s familiárním výskytem a dobře
definovaným mendelistickým způsobem dědičnosti (zpravidla AD), časnou
manifestací (dětství, adolescenci či časná dospělost) a bez vztahu k obezitě
­ cca 6 typů (MODY1-6)
­ patofyziologie: geneticky podmíněná dysfunkce -buněk ale dlouhodobě
měřitelný C-peptid bez známek autoimunity
­ dvě podskupiny
MODY v důsledku mutací v glukokináze (MODY2)
lehčí forma bez výrazného rizika pozdních komplikací
MODY v důsledku mutací v transkripčních faktorech (ostatních 5 typů)
těžké defekty -buněk progresivně vedoucí k diabetu se závažnými pozdními následky
postižena glukózou stimulovaná tvorba a uvolnění inzulinu a proliferace a diferenciace -
buněk
MODY lokus gen produkt prim. defekt závažnost komplikace
1 20q HNF4A hepatocyte nuclear factor-4 pankreas vysoká časté
2 7p GCK glukokináza pancreas/játra mírná vzácně
3 12q TCF1 (HNF1A) hepatocyte nuclear factor-1 pancreas/ledviny vysoká časté
4 13q IPF1 insulin promoter factor-1 pancreas vysoká ?
5 17q TCF2 (HNF4B) hepatocyte nuclear factor-1 pancreas/ledviny vysoká renální
6 2q32 NEUROD1 NEUROD1 pankreas vysoká ?
19
Funkční význam asociací
glukokináza
­ "glukózový senzor"
(vázne uvolňování
a produkce
inzulinu)
HNF
­ většina
transkripčních
faktorů původně
popsaných ve
spojení s jaterním
metabolizmem je
rovněž zapojena ve
vývoji pankreatu a
B-bb.
IPF1 a NEUROD1
­ ovlivňují transkripci
inzulinu
20
Hyperlipidemie ­ příklad 3
etiologicky jsou to onemocnění
buď
­ primární - geneticky založená
­ sekundární - doprovázejí jiná
onemocnění
genetická dispozice
­ polygenní
podobně jako u dalších
,,civilizačních chorob" (tzv.
"střádavý" genotyp)
na manifestaci poruchy se
výraznou měrou podílí faktory
zevního prostředí, především
dieta
­ monogenní - většina primárních
HLP
plynulá distribuce znaku - hladin
cholesterolu - v populaci
­ kvantitativní znak (QTL)
osoby s FH
­ monogenní nemoc
21
Cholesterol - LDL - LDL receptor
22
Fam. hypercholesterolemie (FH)
nejčastější primární HLP
­ heterozygoti se vyskytují s frekvencí 1:500
­ homozygoti 1:1 mil.
FH je způsobena mutací v genu pro LDL receptor (chromosom
19)
­ bylo popsáno více než 700 různých mutací
LDL receptor (spolu s částí membrány ­ "coated pits") periodicky
(cca 1 × 10min) recykluje mezi cytoplazmou a membránou a
pohlcuje LDL částice, po jejich uvolnění se vrací zpět do membrány
­ LDL je působením lysozomálních enzymů rozložen na volný cholesterol a AK
(z apolipoproteinů, zejm. apoB)
z funkčního hlediska spadají jednotlivé mutace do jedné z pěti
kategorií, podle toho zda vedou k:
­ 1) úplné ztrátě receptoru (17 % případů)
­ 2) poruše transportu receptoru do plazmatické membrány (54 %)
­ 3) poruše vazby LDL
­ 4) poruše internalizace receptoru po vazbě LDL
­ 5) poruše uvolnění z endozomu po internalizaci a návratu do plazmatické
membrány (22 %)
zvýšení plazmatického cholesterolu se liší podle typu mutací a
hetero- či homozygotnosti (tzv. ,,gene-dosage" efekt), ale je vždy
značné
­ cca dvojnásobek normálních hladin [<5.2mmol/l] u heterozygotů a čtyř- až
pětinásobek u homozygotů
důsledky FH
­ u nemocných se tvoří mnohočetné xantomy, příp. šlachová xantelazmata a
arcus corneae
­ ale hlavně nemocní s nerozpoznanou a neléčenou FH jsou zejm. ohroženi
předčasnou aterosklerózou a časným úmrtím zpravidla na fatální infarkt
myokardu
u heterozygotů se manifestní kardiovaskulární onemocnění objevuje ve čtvrté
dekádě
u homozygotů již v dětství a pokud je FH neléčena, vede k úmrtí ve druhé
dekádě.
mortality of MI in very young age in unrecognised homozygotes, before the
4th
decade in heterozygotes
molekulárně-genetická diagnostika suspektních případů a rodin,
dispenzarizace nemocných a agresivní hypolipidemická léčba je
podstatou sekundární prevence