Struktura lidského genomu Historický úvod Základní poznatky o struktuře lidského genomu (DNA, nukleosomy, chromatinové vlákno) Metodické přístupy Chromosomy (stavba, členění, teritoria - CT) Globální struktura genomu (stavba CT, radiální vs angulární distribuce, pohyblivost molekul a CT) Jádro buňky( Buňky a jejich jádra jádra ^^^■T^^B KJI ■■* / l \ ^1. Ji I f Robert Brown, 1831) Jádro předává dědičnou informaci (Haeckel 1866) V jádře je obsažena kyselá látka - nuklein (DNA) (Miescher 1869) Nukleová kyselina vs protein (Miescher 1874) Dělení buněk (Walther Flemming, 1882) Buňka před dělením Mitotické chromosomy | Chromosom Centro mera Walther Flemminq: zkoumal dělení buněk, první pozoroval chromosomy, zavedl po' mitóza a chromati První představy o struktuře genomu Dlouhou dobu se vědci domnívali, že nukleová kyselina v jádře buňky je rozprostřena náhodně všude se stejnou pravděpodobností. Pozorování mitotických chromosomů však vedlo již koncem 19. století některé badatele k závěru, že také v interfázi si mohou chromosomy uchovat svou identitu (genetickou a strukturální) (Rabi 1885, Boveri 1888). Theodor Boveri: dědičnost je vázána na chromosomy (1887), po znovuobjevení Mendlových zákonů Hugo de Vriesem (1900) pokračuje ve výzkumu dědičnosti Základní poznatky o struktuře genomu Primární a sekundární struktura DNA Nukleosom a chromatinové vlákno Chromosomy a génom Primární a sekundární struktura DNA -OP-O Řetězec fosfát-cukr Dvojice baží Watson a Crick, 1953 Nukleosom DNA H1 histon 6 nm Nukleosomove jádro (oktamerní komplex histonů) Roger Kornberg, 1974 Chromatinové vlákno 30 nm 6-8 nukleos. 11 nm Histon H1 6 nm Nukleosom Spojovací DNA Nukleosomove jadro DNA, nukleosomy, chromatin, Chromosom a genom Chromosom Buňka Chromati nové vlákno Nukleosomy 9 W4& DNA Metodická část Techniky používané pro studium struktury lidského genomu Buňky a jejich fixace FISH a 3D-FISH In vivo techniky (SRL, GFP) Kombinované značení Konfokální mikroskopie Analýza obrazu luoresce itu H< Chromosomova DNA A T C G T A G C A T T A De natu race DNA proba (sonda) in Druhy sond pro FIS a b d Sondy specifické pro určité geny (sekvence) Sondy specifické pro repretitivní sekvence v okolí centromer Sondy specifické pro telomery "Paintingové" sondy pro celé chromosomy Chromosomy obarvené FISH technikou 3D-FISH a konfokalni mikroskopie ■ í 1 i l i * l | v * Galerie optických řezů Maximální obraz Všech řezů 3D reconstrukce CT Weierich et al., (2003) in press Značení buněk metodou SRL (scratch replication labeling užitím nukleotidů konjugovaných s fluorochromem %V f»« V (SRL on neuroblastoma cells wľ ' - fixed 30' after labelling) Schermelleh et a. (2001) Chromosome Res. 9:77-80 Vizualizace vazebných míst proteinu V DNA in vivo Domoci G Do buňky se vloží plasmid kódující daný protein konjugovaný s GFP Chromosomová DNA Syntéza konjugo-vaného proteinu H2B histon GFP Protein se váže na cílová místa v DNA, Která potom zeleně fluoreskují TT7 C G T A G C A T TA A T C G T A G C A T T A SRL pomocí Cy3-dUTP a segregace chromosomových teritorií u jader HeLa buněk s histonem H2B konjugovaným s GFP (zelená) 1st cycle 3rd cycle after at least 6 cycles Sekvenční vizualizace užitím imunochemických a FISH technik WR:000G:000B:050X:448Y Kg ■^J.I,I.M.I,l.lJ,l.l.m- jn|x|| protilátek) Topoisomeráza alfa 2.značení užitím hvbridizace IjaiRiOOO G:000 B:000 X:40 Y:39 Tentorium HSA17 Cytometrie s vysokým rozlišením (automatizovaná konfokální mikroskopie) ZEISS A100+ CARV LEICA + CSU-10a D oftware pro snímání obrazu a jeho analýzu Umožňuje nastavení řady uživatelských parametrů pro snímání (pozice na sklíčku, meandrovité snímání, počet řezů, krok vertikálního posunu, počet a druh fluorochromů, rozsah intenzit apod.) Analýza se provádí buď manuálně nebo automaticky. Při automatické analýze lze obvykle zadat řadu parametrů pro segmentaci obrazu a 3D analýzu signálů Automatická analýza obrazu Automatická an Signal attributes: Hybridization #1 Probe #2 Signal type: Gene X: 693.21 V: 570.92 Z: 45.00 6X\ 4.83 dY: 6.61 dZ: -24.20 %R: 24 Intensity: 63 Height: 51 Size: 38 FWHMx: 0 FWHMy: 0 FWHMz: 0 Intensity criterion: 2 of 2 Height criterion: 2 of 2 Size criterion: 2 of 2 Do you want to delete this signal? Ano |-; Ne J Chromosomy Uvod - mitotické a interfazni chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Klasické barvení chromosomu A \ 3 ; > ^ ^^ &555 Chromosom barvený Giemsou Lidské chromosomy obarvené pomocí multicolor FISH II II «I » «I » »I »t •4 *# 17 IS X Y Významné sekvence na chromosomech INTERPHASE ItjlomíFTfl — rtpllcactoň — origin c&nlrurriĽru — n MIOSIS I-----------------------1 *yft DĽľt t>H Ul m^Dticspindk INTEHPIiAf.r i 1 II t + i i It n dupľ^atcd >n separate ĽľlLs El Chromosomová teritoria (CT) První experimenty, které vedly k závěru, že chromosomy se nacházejí v jádře v podobě ohraničených domén, byly pokusy T. Cremera v létech 1982-1984. Zavedení FISH podstatně urychlilo poznání chromosomů jak v mitóze, tak v interfázi. Chr 1 ? 3 a 10 jim d ^__ y m xa 10 j^m 1-----■-----1 1----------------1 Funkční uspořádání genomu v jádře Jadérko Chromatinová vlákna i v i ü Chromosom Prot komplex Jaderne pory Transkripce Chromosomy Uvod - mitotické a interfazni chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Struktura CT - CT je tvořeno subdoménami Amv vv • • I Verschure et al., 1999 - H2B+GFP a nascentni mRNA (BrUTP) + Cy3 ukazuje, že mRNA se nachází mezi chromatinem vizualizovaným pomoci GFP. Struktura CT - schéma Cytoplasm nuclear envelope Nucleus transcription sites subchromosomal domain chromosome territory chromosome fiber 200-400 n m Chromosomy Uvod - mitotické a interfazni chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Náhodný (Gausovský) polymer v jádře buňky (jsou zobrazeny 2 body polymeru R a R) A random-walk/giant-loop model Interfázního jádra (Sachs et al., 1995) gian" loops" flexible backbone" straight for visual clarity only Multi-loop subcompartment model (Münkel et al., 1999) Existence subdomén uvnitř CT Chromosomy Uvod - mitotické a interfazni chromosomy Barvení chromosomů (klasika, FISH) Významné elementy chromosomů CT a jejich části jsou disjunktní Subdomény CT Chromosom jako náhodný polymer Nenáhodná vnitřní struktura CT Použití více DNA prob pro tentýž Chromosom Signály z první hybrídizace lze rozlišit v druhé q-arm: green 2 yellow 2 red 2 ^ p-arm: red 1 yellow 1 green 1 • p-arm: red 1 " yellow 1 green 1 -----ľZ^3r ^^^ ^^ 1st hybridization - 6 probes 2nd hybridization - 3 probes Cytometrie s vysokým rozlišením - nalezení signálů Topografické parametry jsou vypočteny pro každý signál - souřadnice x, y, z v těžišťovém systému jádra, intensita, výška, velikost apod. Signal attributes: K| Hybridization #1 Probe #1 Signal type: Gene X: 621 Y: 139 Z: 35 ttt: 36 dY: 6 dZ: 2 %R: 75 Intensity: 239 Height: 126 5ize: 24 A1 (FWHMx): 0 A2( F WHMy): 0 A3(FWHMz): 0 Intensity criterion: 1 of 4 Height criterion: 1 of 4 Size criterion: 2 of 4 Do you want to delete this signal? Ano Polární struktura chromosomových teritorií <45 CT 8 in Go-lymphocytes o-lymphocytes Stimulated lym CT 19 Orientace CT v iádrech buně 1) Buněčná jádra rotujeme tak, abychom dostali CT na jednu osu 2) Vypočte se střední poloha CT na této ose iean sition Transformace CT ^ 3) Těžiště CT posuneme podél osy do jednoho bodu - střední polohy 4) Vezmeme tenký řez jádrem kolem roviny vedoucí přes střed jádra a střed CT Orientace CT v jádře buňky X cp O) c o co CD O C "co b t------1------1------1------1------1------r .5 .4 .3 .2 -1 0 1 2 3 4 Distance alonq x-axis [urml Výše popsaným způsobem dostaneme reálné polohy genetických lokusů vzhledem k CT a také do značné míry vzhledem k jádru. Transformace odstraní fluktuace polohy genetických elementů jež jsou způsobené fluktuacemi CT uvnitř jádra Struktura chromosomových teritorii Závěry o nenáhodném uspořádání chromosomových teritorií: Úhly trojúhelníku jež vznikne ze tří genetických elementů stejného CT v jádře jsou v mnoha případech menší než 60°, tj. hodnota, kterou lze očekávat pro náhodnou strukturu. Orientace jader se zviditelněnými CT a jejich genetickými elementy poskytuje důkaz o orientaci a polaritě CT. Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře pro různé typy buněk a různé živočišné druhy (radiální distribuce) Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů - výpočet a porovnání s experimentem Vazba genetických elementů (CT) mezi sebou Genom se příliš nehýbe Polohy chromosomů v jádře se mohou lišit [ Chr. 22 Chr. 8 >hy genetických elementů v jádře Řezy středem jádra z různých jader přeložené přes sebe pro dva geny (c-MYC a ABL) Vzdálenosti g od středu j' mi ABL, IGH a C-MYC v buňkách HL-60 a v G0 lymfocytech -Q 03 -Q O _ l_ CL 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 -Q 03 -Q O -Q 03 -Q O ABL | HL-60 | ŕ N | / s2=1,54 N# i y R0=48 >► or=35 20 40 60 80 0.14 i IGH 0.12 HL-60 0.10 0.08 0.06 / 9 ¥ 0.04 0.02 0.00 / s =2.28 \ R0=60 \ cjr=30 20 40 60 80 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 ■ c-MYC HL-60 / s2=1.22 / Ro=72 ' or=28 ABL I Go-lymphocytes 100 0 20 40 60 80 IGH B-lymphocytes cjr=36 100 0 20 40 60 80 c-MYC Go-lymphocytť 20 40 60 80 100 0 Radial distance [%] 100 100 20 40 60 80 100 Radial distance [%] Uspořádání chromatinu homologního k lidským chromosomům #18 a #19 se u lymfoidních buněk zachovalo v průběhu evoluce vyšších primátů o c . Human (HSA) n = 31 2.5 -2 - 1.5 -1 -n ^ - 0- 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ^ ^ - Marmoset (CJA) 'i - n =38 i i \ 2.5 - ------------í.-----------i-----------\------------\-----------fc..-. =.------------ 2 - ..........\.........{.........\..........\Jr^--"\..........\^y -x^r^-^lví..... 1.5 - ..........\.........i.........-i.....-yf i..........|....... :*^.-> (0 i_ Q_ 0.03 -0.02 -0.01 - / / v— o ■u o Q. > a. Q. 0.03 -0.02 -0.01 : 0 00 - s T \ 1 \ 1 1 1 1 1 1 1 Iffl 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 lTl 1 MVfflif > 0.00 —11111111111111111 f 111111111111111111111111111111 ľ 0.0 0.5 1.0 1.512.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5. 0 0.0 0.511.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Minimálni vzalenost lokusůl Minimjalni vzdálenost lokusu pro pro chromosomy 8 a 22 chroi/iosomy 9a 22 [MHBké piOTjadu dvojic genů a buněčných typů ABL a BCR geny v Go-lymfocytech Vazba n Geny RET a H4 v buňkách štítné žlázy iezi genetickými lokusy Vazba mezi geny Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře Radiální distribuce, hustota provděpodobnosti Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů -výpočet a porovnání s experimentem Genom se příliš nehýbe, ke změnám dochází v mitóze nuclear volume: 1200 |jm3 ^ Oh: 30 1780 jjm3 12h:30 Walter et al. (2003) J. Cell Biol. 1 BO: 685 o Ü c s U) 14 -I 12 10 8 6 4 2 J 0 normalized distances 0:00 Walter et al. (2003) J. Cell Biol. 160:685 I T 2:00 4:00 6:00 8:00 10:00 12:00 time [h] A(max-mir 'CT1-CN 0.91 CT2-CN 1.19 CT3-CN 0.73 'CT4-CN 0.57 mean ± SD 0.85 ± 0.27 A(max-min )[M m] CT1 ■ -CT 2 1.11 CT3- -CT1 1.04 CT3- -CT 2 1.54 mean ± SD CT 4- -CT1 1.48 1.37 ±0.25 CT 4 -CT 2 1.66 CT4- -CT 3 1.37 5793 HeLa buňky stabilně exprimující H2B-GFP before bleaching Walter et al. (2003) J. Cell Biol. 160:685 Jak se bude chovat nevysviceny chromatin v průběhu cyklu ? Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře Radiální distribuce, hustota provděpodobnosti Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů -výpočet a porovnání s experimentem Genom se příliš nehýbe, ke změnám dochází v mitóze Změny genomu: diferenciace, reparace, apoptóza, transformace Globální struktura u nádorových buněk Změny struktury genomu v průběhu diferenciace (Bártová et al., 2000, 2001, 2002) granulocytes Změny struktury genoi (Bártová 0.030 0.025 °- 0.020 -\ I 0.015 -\ co al 0.010 -] 0.005 0.000 -•— HL60 cells •O- RA/DMSO, 6 hours -a- RA/DMSO, 7 days 20 40 60 80 100 Center-to-gene fractional distance, r [%] !5 CO -Q o 0.030 0.025 0.020 0.015 4 0.010 -j 0.005 -j 0.000 HL-60 control RA/DMSO, 6 hours RA/DMSO, 7 days _dd1 ,—i—i—|—i—i—i—|—i—i—i—|—i—i—i—|—i—i—. 0 20 40 60 80 100 Center-to-domain distance, r [% of radius] U.UUilU B I I HL-60 control 0.0020 - I I RA/DMSO, 6 hours Q- ^m RA/DMSO, 7 days Ž* 0.0015 - !5 | 0.0010 - I ri n Q- li n 0.0005 - ■ h 0.0000 - JJ u lil I li LkJ. U O Hi,IK r Změny struktury genomu po indukci fúzního proteinu PML/RARa (Falk M. et al., 2003) protein PML (nuclear bodies) fusion protein PML/RARa (microspeckles) 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 -\ 0.000 Centromere 6 Nuclear center-to-centromere distances ^hi iM ji M Centromere 6 Centromere-to-centromere distances o 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 -\ 0.000 Centromere 9 Nuclear center-to-centromere distances jW «j mi Centromere 9 0.025 -j Centromere-to-centromere distances 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 Centromere 17 Nuclear center-to-centromere distances 0.030 n Centromere 17 0.025 -j Centromere-to-centromere distances 0.030 n TP53 gene 0.025 0.020 0.015 -| 0.010 0.005 0.000 Nuclear center-to-gene distances H i M ji JL 0 20 40 60 80 100 Distance in % of radius TP53 gene Gene-to-gene distances 0 50 100 150 2 Distance in % of radius lu 75 73 71 | 69 67 | 65 ML-1 Centromere 6 70 i 68 | 66 64 62 60 ML-1 Centromere 9 105 -i 102 \ 99 -| 96 -93 -90 - ML-1 Centromere 6 99 -i 96 \ 93 \ 90 -| 87 84 ML-1 Centromere 9 Time after irradiation (h) B 72 i 70 68 66 64 62 J U937 Centromere 8 U937 Centromere 9 102 -99 -96 -j 93 \ 90 -| 87 U937 Centromere 8 105 102 99 96 -j 93 -| 90 U937 Centromere 9 Time after irradiation (h) Změny struktury genomu v průběhu apoptózy Fragmentace CT 11 (zobrazeno CT, centromera a překryv obou obrazů) Apoptická tělíska a rozpad CT 21 Uspořádání genomu v jádře buňky Rozdělení genetických elementů v jádře Radiální distribuce, hustota provděpodobnosti Úhlové distribuce pro geny a CT- interpretace Vzájemné vzdálenosti genetických elementů -výpočet a porovnání s experimentem Genom se příliš nehýbe, ke změnám dochází v mitóze Změny genomu: diferenciace, reparace, apoptóza, transformace Globální struktura u nádorových buněk Radiální rozdělení genetických lokusů v buňkách HL-60 a v buňkách střevní tkáně Spatial distributions of the BCR, ABL and c-MYC genes in HL-60 Spatial distributions of the BCR, ABL, and c-MYC genes in colon cells Střevní tkáň °" «>" & § 8 8 3 o Q -""«iiSIiii Vzdálenost signál u od střed u jádra [ %] Mean values of radial distributions: 45.0±2.2% (ABL), 42.3±2.6% (BCR), 60.8±0.7% (c-MYC), 56.9±1.3% (cenl), 61.5±1.4% (cen 8) a 65.8±1.0% (cen 9). The parameters do not differ significantly for HL-60, HT-29 and colon tissue cells. Radiální distribuce fúzního genu BCR/ABL ABL-BCR distances in control and leukemic cells 0.04 Healthy donor i 0 20 40 60 80 100 Minimal ABL-BCR distance CM L patient 100 Minimal ABL-BCR distance Spatial distributions of BCR, ABL, and BCR/ABL 0.030 0.025 H I 0.020 c T3 0.015 -\ s 0.010 H 05 S 0.005 Q_ 0.000 í II D BCR D ABL D BCR/ABL nH —i-----------------1-----------------1-----------------1— 0 20 40 60 80 1001 Centre-to-gene distance [%] Radiální distribuce fúzních genů v buňkách Ewingova sarkomu Radial 3D distributions of EWS and FLI genes in human lymphocytes Radial 2D distributions of EWS, FLI and both fusion loci in Ewing sarcoma cells C/) c Q) "O >? CO -Q O 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 CN -to- EWS distances mean = 56.8 + 0.7 % n 20 40 60 80 100 CN -to- FLI-1 distances mean = 68.2 + 1.7 % n n a 20 40 60 80 100 Centre-to-gene distance CO c 3Í mRIMA l_",_n_o TuTiirPr :i uir Ü1.-J xir Lr_nJ U v CodGn Protein {ammo acid chain) Methionine Proline Leucine Alanine Arginlne Skladba lidského genomu Mitochondriální (MCH) genom (Anderson 1981) 14.5 kb, 0.5% celého genomu, dědí se výhradně od matky, při dělení buňky MCH DNA segreguje náhodně, - syntéza na MCH ribosomech (vlastní rRNA a tRNA); MCH genom je kompaktní - kódující Jaderný genom 24 různých molekul, 22 autosomů, 2 pohlavní ehr., velikost 50-250 Mb, 70% tvoří sekvence mající určitý vztah ke kódující DNA (včetně intronů a regulačních oblastí) 10% tvoří repetice (např. AI u sekvence) 10% tvoří transpozony Počty genů u různých organismů Mycoplasma (600) ;ľľ:--:--::t:.:.-;::1.:! í: ',■;:.- ■ :- -: - Escherichia coli (4000) ■ ■ ,:•: : ■:■. . • .....,::: : ■:-. . • ......:• ■ : ■:-. . --■■■■.....: ■--■■■■•■■■■;.:'": í^!Í;::''r,":íE člověk 's* 's* r ■...- ■"..•;J '■"; ::,V + vyssi organismy (25 000) : l 88Ü m .":-:;■•::, * —.— ;:■:;■,:■::-::■■::, . ■;■■ ■.;•-,;•. ;"-:;-::, . :-!"[""." ,;;:-:;-::, ♦ ■;■■ •.•.—,: ■.;;:-:;■::, , ■;■■ ■.;•;;•, :::■::■■::, . ■.:í:-a:V» r ■■:■■ Sfs:.:;:-:»:^« » ■:■■ :;tt:.:;:-:;:t% . j: :."í í;m- __;■■ .;; ,__: rrri ;\: ^"L£T'.:.J: »'z ilu' 'ES'tSii'I": ::r:.!ľ-.;-:"i'!'!i:■ \-'i :.:i.'.'■.:-ľ' 1 ■";!,■''■■ • i ■':-:'- ' -:■■- ::■ ,nši:-'' ""v ' ."::??. "-.-v ' .":::■-■ ' ■.KrarV» , .... .;-r.;..-:í-»:< , .... lř„;,_....:ř-::^ j: :."í í;m- __;■■ .;; ,__: rrri ;\: ^"L£T'.:.J: :jrr ilu' '' ""'■ "V" !:'•;'-'.'-■"" ' ^ :':■:- - ' ~: ~-""" :!:T." V ".''.ľ. '.'"" '.'".'■ V ~~.''.~S. '/." '.'".'■ JSttgýi. w ■:■■ i^r:.:;:-:;:^* . ■:■■ i^r:.:;:-:;:^* » _;: :."í rii- ••• .*; ,__: :.-i ;;„ ^ "V £'.■./ Wi Eu' ■:■■ ňtlr.Ki-Sr^Tt. * ; .. : - ■ Skladba genů u pro- a e u ka ryot Genom e u ka ryot obsahuje mezi kódujícími sekvencemi řadu nekódujících oblastí - intronů coding region bacterial gene coding regions (exons) noncoding regions (introns) _ / _\ eucaryotic gene 1998 GARLAND PUBLISHING Geny: prům. velikost 10-15 kb ale variabilní od stovek bp- Mb (tRNA - Dys); exony činí od 100% až po 0.6% (Dys) Intronyjsou velmi variabilní: 0-118 na gen (u colagenu); délka 0.5 kb pro ß-globin až po 30 kb pro dystrof in Rozdíly v regulaci u pro- a e u kary ot Exprese u prokaryot je typicky regulována v rámci operonu -souboru kontrolních sekvencí v bezprostřední blízkosti protein-kódující sekvence Eukaryotické geny jsou rovněž regulovány souborem kontrolních sekvencí, které se nacházejí poblíž protein-kódující sekvence, ale operony zde neexistují. V eukaryotických buňkách je jádro - regulace je komplexnější (transkripce a translace jsou odděleny). Introny se u bakterií téměř nevyskytují a regulace sestřihem se uplatňuje pouze u eukaryot Existuje krátkodobá a dlouhodobá regulace transkripce. Možnosti regulace exprese u e u ka ryot Jádro DNA RNA transkript Cytoplasm; mRNA + mRNA regulace degradace mRNA inaktivní mRNA regulace transkripce regulace sestřihu regulace transportu a lokalizace regulace translace protein regulace degradace a aktivity proteinu Epigenetická regulace exprese Epigenetika zahrnuje jevy související s dědičnou modifikací struktury a transkripce chromatinu jež navazuje zejména na: - modifikace histonů - metylaci DNA - strukturu chromatinu a genomu Patří zde PEV, umlčování genů heterochromatinem, LCR regulace, regulace vývoje a diferenciace Polycom and trithorax proteiny, imprinting a další jevy. Nepatří zde vliv vnějších faktorů na expresi buněk. „Position effect" u kvasinek a Drosophily ADE2 gene at rormai locfltľor orichramosomíi wliiti! nri-lnny cif yeas: r-Mr with whhe*oCEi?rr ^öf J gene m uverí near idomcrc wň/teg a-n b ^ L nurlTiUl location hŕiŕiEiKhrOíTiflľin rurc chrarocjsümc whfie gene Po ozáření se u Drosophily objevila mutace při niž se červené facety očí změnily zčásti na bílé. Cytogenetická analýza ukázala, že došlo k inverzi chromosomu, kdy se gen označeny jako „white" přesunul do blízkosti heterochromatinu. Jev bylo možno potlačit nebo naopak zesílit. Časem bylo nalezeno 50 genů modifikujících tento fenomén - Su(var) nebo E(var). Nejlépe charakterizovaným modifikatorem je HP1 protein. HP1 obsahuje evolučně stálou chromo doménu, která se vyskytuje také u vývojového regulátoru Polycom (PC) proteinu. Dalším je pak SUV39H1, který je příbuzný trithorax (TRX) proteinům a zajišťuje metylaci H3-K9. Úloha heterochromatinu při řízení exprese Heterochromatin - tmavě zbarvená část chromatinu, - kondensovaná po dobu buněčného cyklu - nachází se hlavně v centromerických a telomerických oblastech -je genově chudý, - obsahuje repetitivní sekvence - nachází se většinou na okraji jádra - DNA v heterochromatinu je špatně přístupná pro transkripční faktory, - histony jsou málo acetylovany a hodně metylovany na H3-K9 - obsahuje HP1 protein vázaný na metylovany H3-K9 Úloha heterochromatinu při řízení exprese Dvoustupňová regulace exprese (Francastel et al., 1999) B 0.5 í 0.4 a> E 0.3 o +-» c