Molekulární genetika člověka Somatické mutace a rakovina v Jana Smaraova Ustav patologie FN Brno - Bohunice Př.F a LF MU Brno 2007 Nádor, tumor, neoplazma, novotvar - je geneticky podmíněný abnormální přírůstek buněčné tkáňové hmoty klonálního charakteru. Jeho růst r\er\\ v koordinaci s růstem okolních tkání a rovnovážným stavem organismu. Nádor je komplexní tkáň fibroblasty nádorové buňky nádorové buňky buňky imunitního systému endoteliálm buňky V nádorové tkáni se vyskytují nejenom transformované nádorové buňky (a), ale také další buněčné typy, které I'l'll'I'li'l'I'IIM1] vývoji nádoru (b). Kancerogeneze - je proces vzniku a vývoje nádoru - její podstatou je postupné hromadění genetických (a epigenetických) změn NummlťLL bmňka Normilni huňkj š&U- Neoplastícka transformace - je přeměna somatické buňky v buňku nádorovou Vícestupňová kancerogeneze spojená s MET normální soutěžící subklony buněk buňky ROKY maligní klon Kolik a které geny jsou změněny během kancerogeneze? Nádor r\er\\ monogenní onemocnění (X vrozené dispozice k nádorům!!). Odhaduje se, že pro vývoj nádoru je nezbytných 4 7 událostí (zásahů). Konkrétních genů, které mohou být během kancerogeneze změněny, jsou desítky (350, 600?), Obecně existuje šest (sedm?) základních vlastností plně maligního nádoru: Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost příklad Soběstačnost v produkci růstových signálů aktivace W-ras Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. Poškození apoptózy Neomezený replikacní potenciál Posílení angiogeneze Tvorba metastáz ztráta RB produkce IGF aktivace telomerázy produkce VEGF inaktivace E-kadherinu Nestabilita genomu jako podmínka akumulace všech nutných změn? poškození apoptózy soběstačnost v produkci růstových signálů posílení angiogeneze ^v neomezený replikační potenciál necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus tvorba metastáz nestabilita genomu Kancerogeneze má individuální průběh Individuální je: poradí zásahů počet zásahů konkrétní zasazené oer\ Onkogeny Protoonkogen je strukturní gen eukaryotické buňky, který se svým translačním produktem podílí do značné míry na regulaci dělení buněk a jejich diferenciace. Onkogen je Protoonkogen pozměněný/aktivovaný tak, že vyvolává neoplastickou transformaci buňky. Aktivace protoonkogenu je přeměna protoonkogenu na onkogen. Mutace protoonkogenu jsou: - aktivující - dominantní - vyskytují se v somatických buňkách a jen výjimečně v zárodečných buňkách Nádorové supresory Produkty genu pro nádorové supresory (antíonkogeny) v normálních bunkách nevyvolávají proliferaci, ale naopak ji potlačují a udržují buňky ve stadiu klidu (60). Jejich ztráta se projevuje neregulovanou proliferací. Mutace nádorových supresoru jsou: - inaktivující - recesivní („recesivní onkogeny") - spojeno s LOH - vyskytují se v somatických a také v zárodečných buňkách Onkoaenní (nádorové) RNA vir Retrovíry - obsahují ve svém genomu onkogen (akutně transformující viry) nebo aktivují Protoonkogen, vedle kterého se integrovaly (pomalu transformující) RNA viry a lidské nádory: • lidský lymfotropní virus typu I (HTLV-1) - T-leukémie (lymf om) dospělých (ATTL) Onkoaenní (nádorové) DNA vír Používají jinou strategii transformace: neobsahují onkogeny, ale kódují proteiny, které interagují s nádorovými supresory (RB, p53, p300/CBP) hostitelské buňky, a tak hostitelskou buňku tlačí do S fáze: SV40: velký T antigen různými doménami interaguje s p53,RB,p300/CBP adenoviry: E1A interaguje s RB a p300/CBP; E1B interaguje s p53 papilomaviry HPV-16, HPV-18: E6 interaguje s p53, p300/CBP; E7 interaguje s RB Onkooenni (nádorové) DNA vir DNA viry a lidské nádory: • Virus Epstein-Barrové (EBV) - Burkittuv lymfom (BL), HodgkinSv lymfom (HĎ), lymfomy, nazofaryngální karcinomy (NPC) • Virus hepatitídy B (HBV) - hepatocelulární karcinom (HCC) • Lidské papilomaviry (HPV 16,18,..) - anogenitální nádory, nádory ústní dutiny, bradavice • Lidský herpesvirus typu 8 (HHV8) - Kaposiho sarkom (KS) Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost příklad ztráta RB aktivace W-ras Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB Poškození apoptózy produkce IGF Neomezený replikacní potenciál aktivace telomerázy Posílení angiogeneze produkce VEGF Tvorba metastáz Nestabilita genomu inaktivace E-kadherinu Je rakovina nemoc buněčného postmitotic ká fáze Ztráta regulace buněčného cyklu je kritická součást buněčné transformace. Ztráta regulace buněčného cyklu r\er\\ jedinou součástí kancerogeneze, většinou sama o sobě r\er\\ plně transformující. Regulace buněčného cyklu - bod restrikce - regulace fosforylace RB Co je poškozeno při transformaci? • nádorový supresor pRB (retinoblastom,..) • nádorový supresor pl6INK4A (melanom,..) • cy kliny Ď (lymf o my,..) • „periferní hráči" - součásti mitogenních a antimitogenních drah Struktura signální dráhy: klasifikace protoonkogenu Růstové faktory • Receptory růstových faktorů a proteiny Ras • Cytoplazmatické prenasece /T^č?^^^^/ • Transkripční faktory Príklady signálních drah signální moieküiy> nrrjTGF.f} Ví TGF-I* rQceptor AD P KE) Růstové faktory a RTK receptory Růstové faktory a RTK receptory po vazbě svých specifických ligandů receptory dimenzují a dochází k autof osf orylaci a také k fosforylaci dalších signálních molekul; tak může být zahájena rada vnitrobuněčných signálních kaskád autof osf orylaci se změní konf ormace - zpřístupní se katalytická doména a vazebná doména pro substráty substráty interagují především prostřednictvím svých SH2 a SH3 (Src-homology) domén Typy mutací postihující růstové faktory a RTK receptory *il.I.HKf«^J|[.(.|.lM»I.|IK^íÉm3iii*T^Éf^«(^*ií«]ÉiiflH nezávislá na vazbě ligandu [•MiiZiiiffiTtra Príklad růstového faktoru: PĎGF PĎGF („platelet-derived growth factor") - účinný mitogen epiteliálních buněk - stimuluje endoteliální a epiteliální buňky k proliferaci v místě poranění - homodimer (AA, BB) nebo heterodimer (AB) dvou príbuzných řetězců A a B: B je kódován c-sis(y-sis přenášen virem opičího sarkomu*, pozměněný B řetězec je konstitutivně exprimován a konstantně stimuluje k proliferaci buňky s příslušným receptorem) - exprese PĎ6F A nebo B nebo obou často detekována u sarkomů, gliomů, karcinomů plic, prsu, jícnu, žaludku, střeva Príklad membránového receptoru - HER2/neu HER2/neu kódován genem c-erb&2 - receptor homologni s E6FR, ale neváže ani E6F ani TGF-a a zrejme ani neu - amplifikace c-erbB2 detekována u adenokarcinomu slinných žláz, prsu, vaječníku, střeva a žaludku; u karcinomu prsu a vaječníku amplifikace a zvýšená exprese c-erbB2 koreluje s horší prognózou a rezistencí k terapii * - amplifikace c-erbB2 detekována častěji ve vzdálených metastatic kých místech než u primárních nádorů Príklad membránového receptoru - HER2/neu * Amplif ikace HER2/neu je uznávaným prognostickým a prediktivním faktorem u nádoru prsu; pacientky s amplif ikací HER2/neu podstupují radikálnejší terapii a mohou být léčeny Herceptinem - monoklonální protilátkou rozpoznávající protein HER2/neu - asi u 33% primárních nádoru prsu a vaječníku detekována mutace v transmembranove doméně V664E dávající vznik variantě pl85erbB2, která je konstitutivně dimenzovaná - konstitutivně aktivní a konstitutivně stimulující MAPK Proteiny Ras Po aktivaci RTK receptoru zprostředkovávají vazbu Raf-1 k cytoplazmatické membráně, kde jsou přítomny další faktory účastnící se aktivace Raf-1, a spoluaktivují Raf-1 Fosforylovane zbytky RTK jsou vazebným místem pro proteiny s SH2 doménami (6RB2). Tyto proteiny jsou f osf orylovány a signál potom přenášejí dále prostřednictvím proteinů Ras. ® j, j, ) r (bi NUCLEUS Proteiny Ras Proteiny H-Ras, N-Ras a K-Ras4A a K-Ras4B (189 AA) mají 188 aminokyselin (p21Ras). Jsou lokalizovány na vnitrní straně cytoplazmatické membrány, kde fungují jako přepínače při přenosu extracelulárních signálů do cytoplazmy. Účastní se řízení buněčného cyklu, diferenciace a apoptózy. Proteiny Ras mají GTPázovou aktivitu: jsou inaktivní, váže-li se na ně 6ĎP, a aktivní, váže-li se na ně 6TP. Vlastní schopnost proteinů Ras vyměňovat 6TP/6ĎP a hydrolyzovat 6TP je nízká, proto nutná účast dvou typů proteinů: Proteiny Ras Proteiny H-Ras, N-Ras a K-Ras4A a K-Ras4B (189 AA) mají 188 aminokyselin (p21Ras). Jsou lokalizovány r\a vnitřní straně cytoplazmatické membrány, kde fungují jako přepínače při přenosu extracelulárních signálů do cytoplazmy. Účastní se řízení buněčného cyklu, diferenciace a apoptózy. Proteiny Ras mají GTPázovou aktivitu: jsou inaktivní, váže-li se r\a ně 6ĎP, a aktivní, váže-li se r\a ně 6TP. Vlastní schopnost proteinů Ras vyměňovat 6TP/6ĎP a hydrolyzovat 6TP je nízká, proto nutná účast dvou typů proteinů: Growth Factors and Other Signals \ ( Guanine nucleotide exchange factor SEFs posilují tvorbu aktivního Ras, který váže 6TP GTPase activating protein GAPs aktivují GTPázu, posilují tvorbu inaktivního stavu Ras, který váže 6ĎP Onkogenní aktivace ras Přítomnost onkogenní mutace ras detekována téměř u 35% nádorů. • Mutace W-ras hlavně u nádorů kůže a dlaždicobuněčných nádorů hlavy a krku. • Mutace K-ras hlavně u adenokarcinomů, karcinomů chrupavek, kolorektálních nádorů a nádorů pankreatu. • Mutace N-ras jsou běžné u hematopoietických malignit, hlavně u AML a MĎS. Onkogenní aktivace ras Onkogenní mutace posilují aktivitu Ras: • V kodonech: 12, 13, 59, 61, 63 - vzniklé proteiny mají poškozenou GTPázovou aktivitu a jsou rezistentní k působení G A? proteinů • V kodonech 16,19,116,117,119,144,146 - vzniklé proteiny mají usnadněnou výměnu 6ĎP/6TP U některých nádorů je zvýšená exprese ras Protoonkoprotein M; _______________________________________________________________________________________ Do rodiny proteinů Myc patří tri odlišné proteiny, které se uplatňují v kancerogenezi: c-Myc, N-Myc a L-Myc Myc je jaderný f osf oprotein s mnoha znaky transkripčního faktoru. Myc tvoří heterodimery s proteinem Max. • Dimer My c/Max transaktivuje několik genů, které se podílejí na řízení buněčné proliferace. • Myc upreguluje aktivitu telomerázy transaktivací katalytické podjednotky hTERT. • Řada genů regulovaných Myc r\er\\ transaktivována, ale naopak jejich transkripce je reprimována. c-Myc, N-Myc, L-Myc Jsou si podobné svou strukturou a mechanismem účinku. Výrazně se liší expresí během vývoje a také se zdá, že ovlivňují - i ve stejném buněčném kontextu -jiné sady genů, participují - i ve stejných buněčných typech - na jiných buněčných programech. Liší se významně také svou úlohou ve vývoji jednotlivých typů neoplastických onemocnění. c-myc a nádory BurkittSv lymfom*. Téměř všechny případy Burkittova lymfomu souvisí s translokací genu c-myc (na chromozomu 8) bud* s těžkým řetězcem \i nebo X nebo lehkým řetězcem k imunoglobulinS (na chromozomech 14, 22 a 2). Někdy bývá translokace doprovázena i výskytem somatických mutací v genu c-myc, a to především v oblasti fosforylačních míst Thr58 a Ser62. Tyto mutace přispívají významně k fenotypu a progresi onemocnění. c-myc a nádory Ostatní lýmf omy: H translokací lq/bcl-2, jen vzácně lze detekovat přestavby c-myc. 60-80% těchto lymfomů transformuje v agresivnější formu a u těch už jsou detekovány i přestavby Ig/c-myc. / / v v • I Aßi »Ji I i Ml i \sm v k i li M í tVM -: heterogenní a asi u 50% lze detekovat translokací Ig bud* s bcl-2, bcl-6 nebo c-myc. c-myc a nádory Solidní nádory: vyskytuje u významného podílu invazivních duktálních karcinomů prsu (spojeno s horší prognózou), u některých nádorů prostaty, u gastrointestinálních nádorů, u některých melanomu a u mnohocetneho myelomu (koreluje s agresivitou onemocnění). N -myc a nádory Amplifikace N-mycse vyskytuje asi u 1/3 prípadu neuroblastomu a je spojena s horší prognózou onemocnění. Zvýšená exprese N-myc byla popsána u významného podílu prípadu malobunecneho nádoru plic a u menšího počtu prípadu medulárního tyroidního nádoru, retinoblastoma rhabdomyosarkomu a nádoru prsu. L -myc a nádory • v • myc) byla pozorována u některých prípadu malobunecneho karcinomu plic. Signální drahá TGF-ß I Plasma mefTitirsne TGFp TGF-JJ neceplor Ulnquityiatiúri j and ttegradartion co-smad; Transcription of target genes Oellufar response; * Differentiation -*------ -ůrowih inhibition * P^PQ^ign tf eKtrgcell^r matric | *Ap0p(ŮS4£ Vazba T6F-ß k příslušnému receptoru vede k f osf orylaci SMAD2 a/nebo SMAD3, ty potom tvoří komplex se SMAD4 a tento komplex migruje do jádra, kde ve spolupráci s dalšími TF spouští transkripci T6F-ß-cilovych genů (napr. p21CIP^pl5INK4B,adalší). =^> antimitogenní signalizace Nádorové supresory Individuální dispozice k nádorům 1. Rozdíly v metabolismu kancerogenu napr. cytochrom P-450, CYP2Ď6, CYP1A1, N-acetyltransferáza,... 2.-3. Rozdíly v DNA repair Mutace nádorových supresoru (a onkogenu) - p53, RB, WT1, BRCA1 a BRCA2,... -RET Penetrance: podíl jedinců určitého genotypu, u nichž se daný specifický genotyp f enotypicky projeví (pravděpodobnost výskytu daného nádoru v určitém věku). Retinoblastom Je vzácné, ale velmi dobře známé nádorové onemocnění dětí. Incidence - 1 na 13.500 - 25.000 narozených dětí. Je prototypickým příkladem vrozené dispozice k nádorům*. Na základě studia epidemiologie retinoblastomu byla vytvořena Knudsonova hypotéza -» KnudsonSv model. RB byl prvním příkladem nádorového supresoru a první klonovaný gen pro nádorový supresor. Vrozená mutace RB (13ql4) predisponuje nositele k vývoji retinoblastomu (maligní tumor, který vzniká ve vyvíjející se retině) v nízkém věku a přináší zvýšené riziko vývoje osteosarkomu. Knudsonuv model dvou zásahu průměrný věk při diagnóze - 14 měsíců bilaterálně v obou očích - v průměru 3 nezávislé nádory v případě časného odstranění retinoblastomu vysoký výskyt osteosarkomu mezi 20. a 30. rokem života často rodinná anamnéza thickening of optic nerve due to extension of tumor I displaced retinoblastoma normal retina DlCjftttiH- GVftodSíitrtĽ»2MlT> bez rodinné anamnézy průměrný věk při diagnóze unilaterální výskyt - 30 měsíců o Knudsonuv model dvou zásahu Knudson (1971): 1. skupina: 1 mutovaná alela genu RB je zděděná (v zárodečné linii), druhá mutace somatická 2. skupina: nezbytnost dvou nezávislých mutací obou alel RB jedna hypotéza vysvětlila dva epidemiologicky odlišné typy onemocnění Knudsonöv model dvou zásahu NORMÁLNÍ, ZDRAVÝ JEDINEC NEDEDICNY RETINOBLASTOM DEDICNY RETINOBLASTOM děděná alela genu RB1 V jedné buňce náhodně mutuje jedna ze dvou standardních alel genu RB1. oooo V jedné buňce mutuje druhá alefa genu RB1. Netvoří se nádor. Druhá aleta mutuje jen velmi zřídka v téže buňce. -*■ Nadměrná profiferace*- buněk vedoucí k retinoblastomu. Pouze asi v 1 ze 30 000 jedinců se vytvoří nádor. U většiny jedinců se vytvoří nádor. Ztráta heterozygotnosti Ztráta heterozygotnosti = LOH („lost of heterozygosity") Buňky, které nesou jednu mutovanou alelu nádorového supresoru, ztrácejí velkou část (delece) chromozomu, který nese funkční alelu. Předpokládá se, že v oblastech s vysokou frekvencí LOH leží geny nádorových supresoru. • Buňky, které nesou jednu mutovanou alelu nádorového HaCttli ížAiVíäSE funkční alelu. Ztráta heterozygotnosti mutace X vatele genu RB1 mateřského chromozomu ■ 1 1 standardní alela genu RB1 v otcovském chromozomu ztráta heterozygotnosti I m SS nondisjunkce nondisjunkce mitotická {ztráta a duplikace rekombinace chromozomu) ! hi ! genová delece bodová konverze mutace RB: gen a protein gen je lokalizován na chromozomu 13 jaderný (85%) protein ppllORB (velikost 112 až 114 v proliferujících buňkách) V nedělících se buňkách je RB v komplexu s TF E2F. E2F transaktivuje sadu genů, které jsou nutné k S fázi buněčného cyklu. RB blokuje E2F a tím blokuje buněčný cyklus („brzda buněčného cyklu"). Hladina proteinu RB se v buňkách nemění během b.c., ale mění se stupeň fosforylace RB. Na molekule RB je asi 10 až 12 různých fosforylačních míst (Thr, Ser). Hyposf orylovaný RB je aktivní a váže E2F, f osf orylovaný RB je neaktivní. RB a regulace buněčného cyklu (jjyklin B) cyklin A /-"V, GO mitogenní signály t :INK4B ■ INK4A an ti mitogenní signály Způsoby inaktivQce RB v nádorech Samotný gen RB může být mutován, deletován, může být metylovan jeho promotor (retinoblastom, malobunecný karcinom plic, sarkomy, karcinomy močového měchýře). Vazbou virových proteinů E1A, LT SV40, E7 (karcinom děložního čípku). igwimginnisiti dlazdicobunecne karcinomy) nebo zvýšenou expresí cyklinu Ďl díky chromozomální translokaci (lýmf omy B buněk). Potenciálně onkogenní virus Herpesvirus saimirikóduje svůj vlastní cyklin Ď. Způsoby ínaktívace RB v nádorech • Amplif ikací Cdk4 (glioblastomy, gliomy). • Ďelecí pl5, pl6 nebo obou (dlaždicobuněčné karcinomy jícnu, glioblastomy, karcinomy plic, močového měchýře a pankreatu). Ektopicka exprese „wild-type" RB r\er\\ inhibující pro proliferaci, protože RB je fosforylovan a inaktivován endogenní aktivitou komplexů cyklin/cdk. Li-Fraumeniho syndrom Vzácné autozomálně dominantní dědičné onemocnění. Rodinný syndrom charakteristický častým a časným výskytem malignit různého typu včetně sarkomu, nádoru prsu, nádoru mozku, leukémií. adrenokortikálního nádoru. Nádory u LFS mají tendenci se objevovat u dětí a mladých dospělých, často jako násobné primární nádory. Syndrom spojen s mutací genu pro nádorový supresor p53 (17pl3). p53 je transkripční faktor poškození DNA hypoxie úbytek ribonukleotidů zkrácení telomer a další aktivace onkogenů posttranslační modifikace p53 a MDM2 aktivace a stabilizace p53 kontrolní body buněčného cyklu p21WAF ^ 14-3-3CT Gadd45 Reprimo ubikvitinace a degradace p53 apoptóza PUMA %^ NOXA Bax Scot in KILLER/DR5 P53AIP1 Fas/ApOl/CD95 FasL IGF-BP3 PIGs PIDD oprava DNA Gadd45 £ p48 p53R2 inhibice angiogeneze Tsp1 Balí Maspin GD-AIF fš* p53 - ochránce genomu Inaktivace p53 v nádorech Mutace Jaderná exkluze (37% zanetlivých karcinomů prsu, více než 90% nediferencovaných neuroblastomu) ism E6) Amplifikace /my^ (neuroblastoma, případně mc/mX (gWomy) Frekvence mutací p53 u některých typu nádoru 50 45 40 r-. 35 co 30 25 20 £ 15 10 - m n m íl (/) N (0 SÜ, O. U > í= Mutační spektrum p53 10 o 03 (D Ü C (D > (D 5 - 0 100 200 300 393 kodon Nejčastěji mutované kodóny p53: 175, 245, 248, 249, 273, 282. Signální dráha Wnt-1 /ß-katenin ß-kateniny hrají v buňkách dvě odlišné role a obě tyto role se mohou podílet na kancerogenezľ. 1. Molekuly ß-kateninu jsou strukturální součástí cytoskeletonu a adhezívních komplexu (zprostředkovávají vztah mezi kadheriny a aktinovými složkami cytoskeletonu). Ztráta/změna buněčné adheze se uplatňuje při metastázování nádoru. 2. Volný ß-katenin funguje jako signální molekula dráhy Wnt-1/ß-katenin účastnící se regulace transkripce. Transkripce genů zprostředkovaná ß-kateniny může zapnout geny nutné k buněčné proliferaci nebo geny s antiapoptotickou funkcí. Regulace ß-kateninu Hladina volného ß-kateninu je udržována pomocí tzv. destrukčního komplexu. Ten je tvořen proteiny: GSK-3, Axin, APC a ß-TrCP/Slimb. 6SK-3 serin/threoninová kináza, která fosforyluje ß-katenin (S33, S37, T47 a S45). Tato fosforylace funguje jako signál k následné ubikvitinaci a degradaci ß-kateninu. Axin a APC fungují jakoMlešeníM celého komplexu a podmiňují jeho fungování. Axin obsahuje vazebná místa pro všechny součásti destrukčního komplexu. Aktivace ß-kateninu Aktivace dráhy Wnt - tj. vazba glykoproteinu Wnt-1 na příslušný receptor Frizzled (ale napr. i aktivace E6FR a dalších) vede k aktivaci proteinu Ďsh (disheveled), který interaguje s destrukčním komplexem a znemožní f osf orylaci ß-kateninu. Tak se zvyšuje hladina volného ß-kateninu. Ten se váže na DNA vazebné proteiny (Tcf - „T cell factor", Lef - „lymphoid enhancer factor") a společně aktivují transkripci svých cílových genů. K cílovým genům napr. c-myca gen pro cyklin Dl, což vede ke zvýšení buněčné proliferace. Signální dráha Wnt/ß-katenin Destruction complex en ffK3j£) (^ % l-'-l ŕ ÄJárťcondiEth ") GCFcoTipiex R0l93S0Tie (p-TrCF 0-(p-^t <^ Přebytek volného ß-kateninu je degradován, což je zprostředkováno destrukčním komplexem. Signální dráha Wnt/ß-katenin a nádorů prsu u myší. Mutace APC znemožňující vazbu APC na ß-katenin nebo vazbu APC na axin způsobují konstitutivní aktivaci ß-kateninu. Mutace APC patří k nejčasnějším genetickým změnám při vývoji kolorektálních karcinomů (i vrozené mutace), dávají buňkám růstovou výhodu. Mutace axinu, které znemožňují vazbu axinu na ß-katenin, byly nalezeny u některých hepatocelulárních nádorů. Signální dráha Wnt/ß-katenin a TíT« Mutace ß-kateninu bud* odstraňují serin nebo mění serin na jinou aminokyselinu, což vede ke zvýšení transkripční aktivity a k necitlivosti k APC zprostředkovanému odbourávání ß-kateninu. Mutace ß-kateninu se vyskytují u kolorektálních nádorů, nikdy ne zároveň s mutacemi APC (zákon exkluzivity). Šest získaných vlastností maligního nádoru získaná schopnost příklad ztráta RB Soběstačnost v produkci růstových signálu aktivace W-ras Necitlivost k signálům zastavujícím b.c. ztráta RB Poškození apoptózy produkce IGF Neomezený replikacní potenciál aktivace telomerázy Posílení angiogeneze produkce VEGF Tvorba metastáz Nestabilita genomu inaktivace E-kadherinu Genetická nestabilita nádoru Nádory vznikají postupnou akumulací genetických (a epigenetických) změn genů, které řídí buněčné dělení, buněčnou smrt a další důležité procesy v buňce. Z výpočtu, který vycházel ze známé mutační rychlosti v somatických buňkách (107 na gen na generaci buněk), se zdálo, že k takové akumulaci mutací nemůže během lidského života dojít. Jakým mechanismem dochází k této akumulaci? Genetická nestabilita nádoru K akumulaci stačí normální rychlost mutací ve spojení s vlnami klonalní expanze, které mohou být způsobeny pozitivní selekcí buněk "prenádorových". Akumulace všech nutných mutací umožněna genetickou nestabilitou (tzv. „mutator hypothesis"). Nestabilita je záležitost rychlosti, s jakou k mutacím dochází, existence mutací sama o sobě neposkytuje žádnou informaci o tom, s jakou rychlostí se objevila. Většina nádoru je geneticky nestabilních. Typy genetických změn v nádorech Menší změny v sekvenci DNA - missense mutace, menší delece a inzerce [illälľ MWWJffll celých chromozomů Chromozomální translokace - fúze částí odlišných chromozomů nebo normálně nesouvisejících částí téhož chromozomu Amolif ikace aenS Ke genetické nestabilitě dochází na více úrovních. Nestabilita v sekvenci DNA Nukleotidová excizní oprava („nucleotide-excision repair" - NER) -s ní spojená nestabilita („NER-associated instability" - NIN); Xeroderma pigmentosum (některý ze 7 genů: XP-A až XP-G). Oprava špatného párování („mismatch repair" - MMR) - s r\'\ spojená mikrosatelitová nestabilita (MIN); dědičný nepolypózní kolorektale karcinom - HNPCC -Lynchöv syndrom (některý z genů MSH2, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6). Pacient s Xeroderma pigmentosum Nestabilita v důsledku nedostatečných oprav dvouretezcových zlomů DNA Double-stran d e d breaks / ATM i. Ataxia telangiectasia ,' p53 1 LkFraumenf syndrome \ \ BRCA1 \ ! Familial breast and ] \ ovarian cancer / -iT^- - _ CDS1/CHK2 V Li-Fraurneni syndrome ^- NBS1-MRE11-RAD50 ( Nijmegen breakage syndrome j-\^ Ataxia-telangiectasia-Jike disorder Cell-cycle checkpoints DNA repair modré šipky: fosforylace Tyto proteiny udržují integritu genomu, jejich mutace predisponují k vývoji nádorů. Nestabilita v počtu chromozomů (CIN) Ve sro\/r\ár\\ s NIN a MIN jsou ztráty nebo zmnožení celých chromozomů mnohem běžnější a vyskytují se téměř u většiny nádorů - např. 85% kolorektálních nádorů je vysoce aneuploidních. Souvisí s poruchami kontrolního bodu buněčného cyklu/mitózy: kontrola mitotického vřeténka („spindle check-point") zajišťuje, aby se sesterské chromatidy nerozcházely dříve, než jsou všechny chromozomy správně uspořádány kolem mitotického vřeténka. Kontrola mitotického vřeténka Bub r,2, 3' Mad 1. 2\ 3 Mps 1 OFF _|Cdc2Ü—»-A PC Active Active Anaphase Bub1*,2,3*HCdc20 Mad 1, 2*H 3 Mpa 1 ON inactive Inactive Metaphase arrest Jak je monitorováno sestavování vřeténka? Na nesprávné sestavení vřeténka reagují proteiny typu Bub a Mad a nedovolí aktivaci APC/C (kohesin, sekurin, scparin). Sedm typických znaku nádorových buněk poškození apoptózy 3«£ soběstačnost v produkci růstových signálů posílení angiogeneze neomezený replikačni potenciál necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus tvorba metastáz nestabilita genomu Familial ní adenomatózní polypoza - FAP Autosomálně dominantní dědičné onemocnění. U pacientů s FAP se vyvíjejí stovky až tisíce benigních kolorektálních nádorů, z nichž některé progredují do karcinomů, nejčastěji během druhé a třetí dekády života. Průměrný věk detekce nádoru u FAP pacientů je 40 let. Polypy, které se objevují u pacientů s FAP jsou totožné s polypy sporadickými a také nemají větší riziko maligní progrese než sporadické polypy. Ale jejich velký počet „zajišťuje", že některé se s jistotou v maligní vyvinou. Pacienti s FAP mají zvýšené riziko thyroidních nádorů, nádorů tenkého střeva, žaludku a mozku. Famílíální adenomatózní polypoza FAP je spojena s vrozenými mutacemi genu APC Ten je lokalizován v oblasti 5q21. Během kancerogeneze musí být inaktivovány obě kopie genu APC{<^> častý LOH 5q). Somatické mutace APC^aké hrají klíčovou úlohu při vývoji sporadických kolorektálních karcinomů, jsou detekovány alespoň u 80% všech CRC. Vysoký podíl mutací, které vedou ke zkráceným proteinům. Relativní vztah mezi typem mutace a průběhem onemocnění. Famílíální adenomatózní polypoza Střevní stena pacienta s FAP zdravého jedince Figure 7-22 The Biology of Cancer (9 Garland Science 2007) Dvoii úloha proteinu APC v buňce: A. Regulace hladiny volného ß-kateninu E-Cadherin Nuclear Membrane . Target ^^ Genes Dvojí úloha proteinu APC v buňce: B. účast na tvorbě mitotickeho vřeténka a Wild-1 Csntroson ^m 1 ype oeJls na APC El 3-1 ______ KinätochCHfi ľ fJ^J^M^ZLr***^^ ***^^T^ľ ^~^^-_ u*p- ^^Sbŕ^ 'Kr____ Tílr1 Microtubutes - APC je lokalizováno na kinetochorech metafazických chromozomů. Důsledkem mutace APC je poškození mitotickeho vřeténka a tím zvýšení chromozomální genetické nestability. Dvojí úloha APC při vývoji CRC APC se zrejme uplatňuje jak při iniciaci vývoje nádoru (v důsledku selektivní výhody získané aktivací Wnt/ß-katenin dráhy), tak také v pozdějších fázích vývoje nádoru tím, že je příčinou chromozomální nestability. Mutace APC představuj e nejčastější první krok v kancerogenezi kolorektálního karcinomu Vývoj kolorektálního karcinomu relativně „standardní" průběh od malých adenomů (do 1 cm), přes středně pokročilé (více než 1 cm bez známek transformace) a velké adenomy až po plně rozvinutý maligní CRC A. Normální střevní epitel: krypt, diferencované buňky klků B. - C. vývoj polypu: adenomatózní tkáň Ď. - F. mikroadenomy Vývoj kolorektálního karcinomu Kolorektale karcinomy představují výborný model pro studium kance r oge něze. • relativně „standardní" průběh od malých adenomu (do 1 cm), přes středně pokročilé (více než 1 cm bez známek transformace) a velké adenomy až po plně rozvinutý maligní CRC • souvislost mezi morfologií jednotlivých stadií a genetickými změnami, které se odehrály • model kooperace onkogenu a nádorových supresoru během kancerogeneze Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - aktivace ras Specifické bodové mutace protoonkogenu K-ras nebo bi-ras jsou detekovány alespoň u 50% kolorektálních adenomů větších než 1 cm a asi u 50% karcinomů. Mutace ras jsou jen vzácně (do 10%) detekovány u adenomů menších než lem. mutace ras se typicky objevují při progresi adenomů Frekvence mutací ras u kolorektálních karcinomu 70 60 - +* 50 - (0 c/> 40 - ^ 30 - 20 - 10 - Early Intermediate Late ■ Adenomas Cancer Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - „LOH" 18c Ďelece oblasti 18q detekovány u 50% velkých adenomS a 70% karcinomů. Na chromozomu 18q detekován gen pro SMAĎ4, někdy označovaný jako ĎPC4 („deleted in pancreatic cancer"). SMAĎ4 je součástí signální dráhy T6F-ß. Frekvence delecí oblasti 18q u kolorektálních karcinomů 90 80 70 eo 50 40 tO 30 20 10 £fi &££??-:#.¥ Early Intermediate Late Adenomas Cancer Další stadia vývoje kolorektálního karcinomu - inaktivace p53 Ztráta 17p je detekována u 75% kolorektálních karcinomů. Ztráta 17p je jen vzácně detekována u kolorektá nich adenomů. inaktivace nádorového supresoru p53 je typicky pozdní událost během vývoje kolorektálních karcinomů Frekvence mutací p53 u kolorektálních karcinomů Vývoj kolorektálního karcinomu: model mnoho stupňové kancerogeneze normálni epitel AC F malý adenom strední adenom r~ velký adenom APC K-ras 18q LOH p53 SMAD4 DCC Dekuji za pozornost ! f? r ,u ■<-■>■"- r f i n