#2 Metody a modely vývojové biologie Základní modely • Coenorhabditis elegans (háďátko) • Drosophila melanogaster (octomilka) • Danio rerio (zebrafish, dánio, zebřička) • Xenopus tropicallis/laevis (drápatka, frog) • kuře (Gallus domesticus, chick) • myš (Mus musculus, mouse) Výhody a nevýhody jednotlivých modelů (parametry) • Je model v něčem jedinečný? • Jak moc je model přístupný genetické manipulaci? • Jak rychle je možno provést experiment? • Jak moc je model relevantní pro lidskou embryogenezi a medicínu? • Jak finančně náročné je pracovat s daným modelem? • Další parametry (vhodný pro large-scale screening?, vhodný pro in vivo imaging?, vhodný pro lineage tracing? atd.) Coenorhabditis elegans (worm) • asi 1 mm velký hlíst • levný provoz • mutantní kmeny se mohou uchovávat jako zmražené • vhodný pro poznávání základních mechanismů vývoje a buněčných vztahů • omezená přenositelnost konkrétních poznatků (např. o funkci jednotlivých genů) na další modelové organismy a člověka – důvodem je značná fylogenetická vzdálenost a specifické funkce mnoha genů u C. elegans Coenorhabditis elegans Jedinečnost: omezený počet buněk (přesně 959 u hermafrodita a 1031 u samce) a přesné popsání jejich vzájemných vztahů (mateřská a dceřinná buňka), propojení (neurony) a osudů (diferenciace, migrace, apoptóza) Nobelova cena 2002: Sydney Brenner – otec C. elegans (lineage of C.elegans scientists) John Sulston – zmapoval vývojové linie (kniha Common Thread) Robert Horvitz – popsání prvních genů zodpovědných za apoptózu Coenorhabditis elegans • genom sekvenován 2002, asi 20 000 genů • genetické manipulace – RNA interference (Nobelova cena 2006 – Andrew Fire and Craigh Mello) – ponoření, mikroinjekce nebo nakrmení bakteriema s patřičnou dsRNA • v ČR – skupina M. Jindry a M. Asahina v Českých Budějovicích • užitečné odkazy na: http://www.wormbase.org/ nebo http://www.wormbook.org/ Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster • klasický genetický model už od roku 1909 (Thomas Morgan) • vysoký stupeň poznání genetiky octomilek, nízké náklady a rychlý generační čas (2 týdny) je důvodem pro jejich využití ve vývojové biologii • genom sekvenován 2000 – pouze 4 páry chromozómu Drosophila melanogaster • genetické modifikace: • (i) velké spektrum kmenů s přirozenými nebo indukovanými mutacemi, ktere se naakumulovaly v průběhu 100 let výzkumu octomilek • (ii) transgenní Drosophily s využitím P-elementu a pokročilých genetických technik • (iii) od roku 2000 i specifická rekombinace (knock-out a knock-in kmeny) • (iv) možnosti vytváření chimér a mozaik Drosophila melanogaster • Klíčové objevy: Xenopus (drápatka) • X. laevis – klasický model, tetraploidní – genom není sekvenován a nejsou možné stabilní genetické modifikace • X. tropicallis – nově zaváděný druh, který umožňuje Xenopus (drápatka) • výhody (modifikováno z Wikipedie): • 1) X. laevis is primarily aquatic and can be maintained and bred easily in aquaria • 2) unlike most other amphibians, X. laevis happily feeds on "dead" organic material • 3) X. laevis is very hardy and tolerate a wide range of living conditions; and most importantly • 4) X. laevis can be induced to ovulate and mate anytime of the year following a simple injection of gonadotropic hormones. This discovery in the 1930's became the basis of a simple pregnancy test for humans and led to its worldwide distribution and use • 5. By the late 1950's and early 1960's more sensitive methods for detecting pregnancy were developed and X. laevis were no longer needed for this purpose. However by this time developmental biologists throughout the world had begun to exploit Xenopus embryos as a convenient model system. For the purpose of genetics, and some molecular studies, though, X. laevis is not the ideal system, in large part because it is effectively polyploid Životní cyklus drápatky (X. laevis) Genetické manipulace u X. laevis • GOF (gain-of-function) - overexprese proteinů – mikroinjekce mRNA pro „protein of interest“ do vajíčka nebo buněk časného embrya (podle místa mikroinjekce lze určit ve kterých buňkách k overexpresi dojde) • LOF (loss-of-function) – mikroinjekce anti-sense morpholino-oligonucleotides – specificky se váží na mRNA v místě prvního kodonu a brání tak translaci Danio rerio (zebřička, zebrafish) Danio rerio (zebřička, zebrafish) Výhody • obratlovec • Prolific • průhledná embrya • rychlý vývoj • vnější oplození a vývoj • jednoduchý systém • identifikovatelné, stereotypické neurony • možnost genetických manipulací • A great community! Danio rerio – rychlá embryogeneze Genetické modifikace u Danio rerio kuře (chick) kuře (chick) • vývoj je blízký (i molekulárně) vývoji savců, včetně člověka • embryo snadno získatelné (jako vajíčko) a přístupné manipulaci (po odstranění skořápky J) • dobře popsaný klasický model, který zažívá nový rozmach s nástupem molekulárních technik • jako jeden z prvních použit pro lineage tracing (chiméra kuře x křepelka), buňky se liší tvarem jader Chicken electroporation Elektroporace kuřecí nervové trubice umožnila poznat jakým způsobem buňky během vývoje získávájí a udržují svou identitu Myš • savec • z toho plyne, že embryonální vývoj je ze všech modelů nejpodobnější člověku • genom sekvenován • jedinečný díky možnostem genetických manipulací (transgenní myši) Myš je velmi relevantní model pro studium lidské embryologie Myš - nevýhody • relativně dlouhý generační čas • embrya obtížně přístupná experimentální manipulaci – pouze v děloze matky • finančně náročný model Transgenní myš Příprava myších kmenových buněk Transgenní myš – state of the art: • knock-in myši – umožňují záměny genů, vnesení bodových mutací atd. • kondicionální knock-out/in myši založené na Cre-recombinázovém systému a) pouze v určité tkáni/typu buněk b) pouze po vnější stimulaci (tzv. inducibilní Cre), tj. v experimentálně určeném čase c) náhodně – v určitém procentu buněk, využití pro lineage tracing Výhody a nevýhody jednotlivých experimentálních modelů vývojové biologie -summary Srovnání jednotlivých modelů Závěr: Pro obecné závěry je nejlepší modely kombinovat!