Elektromigrační metody Jsou založeny na pohybu nabiých částic v elektrickém poli Základní síla vyjádřena Coulombovým zákonem F[e] = k . Q[1].Q[2]/ r[12]^2 F[e] = síla působící na částice o nábojích Q[1]a Q[2] o souřadnicích 1 a 2, r[12] = jejich vzdálenost k = 1/4Πε[0], kde ε[0] je permitivita prostředí F[e] = Q.E Kde E = intensita elektrického pole (V.m^-1) F[e] uděluje částici zrychlení, zvyšující se rychlost vyvolá zvýšení frikční síly F[f] opačného směru Sekundární jevy • Jouleovo teplo • Elektroosmóza Jouleovo teplo Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok Původ elektroosmotického toku Elektroforéza „Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit“ Elektroforéza • Volná • Zónová Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Stabilizace • Rotací • Gradienty hustoty • Porézními medii • Kapilárou Požadavky na porézní media • Homogenita • Inertnost - nespecifické interakce - nulový EOF • Reprodukovatelná a snadná příprava • Mechanická pevnost • transparentnost Upořádání Upořádání Chromatografický papír Složení – celulosa - Nehomogenní - Přítomnost ionogenních skupin - Špatně se chladí – pálí se Použití : téměř už se nepoužívá Agar a agarosa Složení – kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy - Přítomnost ionogenních skupin – silný EOF + Velké pory + Snadná příprava Použití : imunoelektroforetické metody elektroforéza NK Acetát celulosy Složení – acetát celulosy + Komerčně dostupný + Dobré mechanické vlastnosti Použití : imunoelektroforetické metody klinické aplikace Škrob Složení – hydrolyzovaný škrob + poprvé se uplatňuje efekt molekulového síta - Špatné mechanické vlastnosti - Komplikovaná a nereprodukovatelná příprava - Není transparetní Použití : izoenzymová analýza Sypané vrstvy Složení – Sephadex – zesíťovaný dextran + uplatňuje efekt molekulového síta Použití : preparativní Polyakrylamid Složení – kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid Polyakrylamid - příprava Radikálová polymerace • Katalyzátor – tetramethylethylendiamin TEMED • Iniciátor - chemicky – (NH[4])[2]S[2]O[8] - fotochemicky – ribloflavin + UV Polyakrylamid - složení Provedení PAGE vertikální x horizontální deskové x trubičkové homogenní x gradientové kontinuální x diskontinuální Provedení PAGE Provedení PAGE Diskontinuální PAGE Orstein, Davis SDS PAGE SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy Použití SDS PAGE • Stanovení Mr • Analýza komplexních směsí • Sledování purifikace bílkovin • Stanovení podjednotkového složení PAGE - sekvenace DNA Izoelektrická fokusace „Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“ Tvorba gradientu Anoda (+) H[3]O^+ 6H[2]O®O[2] + 4H[3]O^+ + 4 e^- Katoda (-) OH^- 4H[2]O®2H[2] + 4OH^- - 4 e^- Izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace Kapilární izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace analytická • Provedení - v gelech – PAGE, agarosa • Použití - sledování komplexních směsí - izoenzymové složení - stanovení pI – rozřezání a eluce – mpH elektrody – pI standardy Izoelektrická fokusace analytická Izoelektrická fokusace analytická Izoelektrická fokusace analytická - standardy Dvourozměrné metody • Metoda titračních křivek • Dvourozměrná elektroforéza Metoda titračních křivek Dvojrozměrná elektroforéza Dvojrozměrná elektroforéza Dvojrozměrná elektroforéza