Základní metody světelné mikroskopie Brno 2004 © 2 Předmluva Předkládáme Vám pomocný text o světelných mikroskopech, abychom Vám umožnili alespoň částečně proniknout do tajů, kterými je obestřena funkce mikroskopů, se kterými pracujete. Neděláme si nárok na dokonalé vysvětlení všech fyzikálních zákonitostí a konstrukčních detailů. Aby text nebyl příliš rozsáhlý a nepotlačil Váš zájem hned při prvním pohledu na něj, pokusili jsme se vybrat z teorie jen to, co je nutné k pochopení popisované metody mikroskopování. Často je to však na úkor přesnosti, za to se Vám omlouváme a doporučujeme vzít k ruce literaturu, týkající se problému. Text není hotový a bude - pokud se nám to podaří - dále doplňován. Prosíme Vás, máte-li jakékoliv připomínky ke zlepšení textu nebo výhrady k případným nedokonalostem, napište nám na adresu evzen.hruska@mikroskopy.cz. Text není určen k prodeji a je Vám k dispozici pouze v elektronické formě na adrese: www.mikroskopy.cz Nemáte-li přístup k Internetu, vyžádejte si text na CD-ROM, pošleme Vám jej zdarma. Naše adresa je uvedena v záhlaví textu. Věříme, že Vám tento náš pokus pomůže při Vaší práci. Ke zpracování textu byly použity firemní materiály Nikon. 3 Pripravil Optoteam, s.r.o., Kyjevská 6, 160 00 Praha 6 Generální zastoupení mikroskopů Nikon y České republice 10-2004 © Všechna práva autorská a distribuce jsou maietkem Optoteam, s.r.o.. Praha Obsah: 1 Nezbytný úvod.....................................................................................................4 2 Základy geometrické optiky..................................................................................9 3 Objektivy.............................................................................................................11 Světelný tok, jas a numerická apertura objektivu...............................................12 4 0kuláry................................................................................................................16 Dioptrie (D).....................................................................................................18 5 Tubus m ikroskopu...............................................................................................18 „Nekonečná optika" mikroskopu (Nikon CFI60)..................................................20 6 Osvětlovací soustava m ikroskopu.......................................................................22 Nastavení KÖHLEROVA osvětlení.................................................................23 Konjugované (sdružené) roviny..........................................................................24 7 Kondenzor...........................................................................................................27 8 Vlnová optika......................................................................................................29 9 Rozlišovací schopnost........................................................................................32 Neostrost způsobená interferencí a ohybem (difrakcí) světla.............................35 Ohybový obraz po průchodu světla....................................................................36 10 Kontrastovací metody v mikroskopii..................................................................38 Pozorování v tmavém poli (v zástinu).................................................................39 Fázový kontrast..................................................................................................41 Hoffmanův modulační kontrast (HMC)...............................................................48 Polarizační mikroskopie......................................................................................49 Dvoj lom světla................................................................................................52 Kompenzátory.................................................................................................53 Interferenční chromatičnosti............................................................................54 Interferenční m ikroskopie...................................................................................56 Diferenciální interferenční kontrast s de Senarmontovou úpravou.................58 10 Fluorescenční m ikroskopie...............................................................................60 Výbava m ikroskopu pro epifluorescenci:.........................................................61 Stručný popis epifluorescenční mikroskopie:..................................................62 Příprava vzorku pro pozorování při fluorescenci:............................................62 Zařízení k potlačení úrovně šumu (Noise Terminátor)....................................63 Zařízení pro vyrovnání excitace (Excitace Balancer) Nikon..........................64 Imunofluorescence..........................................................................................65 Fluorescence in Situ Hybridization (FISH)......................................................65 TIRF -Total Internal Reflexe Fluorescence...................................................65 4 1 Nezbytný úvod Mikroskop (dříve se říkalo „drobnohled") je složitá optická soustava. Účelem mikroskopu je pozorování drobných předmětů (objektů) a jejich detailů při velkém zvětšení. Zvětšený obraz v mikroskopu vnímáme zrakem, musí tedy být vytvořen viditelným zářením (světlem). Oko (receptor obrazu) je zatížené optickými vadami, podobně jako čočky mikroskopu. Navíc je výsledný vjem obrazu složitý psychofyziologický proces, ovlivněný schopnostmi a kondicí pozorovatele. Je proto nutné smířit se s tím, že hodnocení kvality obrazu v mikroskopu zrakem je vždy z velké části subjektivní. Oko vnímá elektromagnetické záření jako světlo v rozsahu vlnových délek přibližně 380 - 760 nm (1 nanometr = 1 x 10"9 m). Lidský zrak má rozdílnou citlivost na vlnovou délku záření. Nejcitlivější je oko na žlutozelené záření s vlnovou délkou kolem 500 nm, v krátkovlnné oblasti končí citlivost oka při vlnové délce 380 nm (ultrafialové záření) a v dlouhovlnné oblasti končí u 760 nm (infračervené záření). Tyto hodnoty se týkají tzv. denního vidění, v šeru se schopnost vnímat rozdílné chromatičnosti ztrácí. Proto hovoříme o světlené mikroskopii, na rozdíl od mikroskopie, kde se obraz vytváří krátkovlnným elektromagnetickým zářením. Viditelný obraz pak získáme teprve použitím obrazového měniče. Na tomto principu je založena elektronová mikroskopie, při které lze dosáhnout mnohem většího zvětšení. Vyspělá mikroskopie nahrazuje oko čidlem kamery a subjektivní hodnocení počítačovým systémem, který provádí kvalitativní nebo kvantitativní analýzu obrazu. Několik slov k termínu „chromatičnosť: Tento výraz dovoluje kvantitativní vyjádření „barvy" na základě srovnání s absolutní teplotou černého zářiče (v kelvinech, K). U záření tedy nemluvíme o jeho „barvě", ale o teplotě chromatičnosti. Termín „barva" je fyzikálně nejednoznačný. Má-li záření jen jednu vlnovou délku, jde o záření monochromatické. U takového záření je vztah mezi chromatičnosti a vlnovou délkou jednoduchý. Chromatičnost záření, složeného z několika vlnových délek, se hodnotí obtížněji, přesně je popisují jeho trichromatické souřadnice. Takové hodnocení může být v mikroskopii součástí obrazové analýzy, prováděné počítačovým programem. U chromatičnosti je nutné rozlišovat, zda je detail sám zdrojem záření (v mikroskopii s procházejícím světlem), nebo zda jde o záření odražené (při mikroskopii neprůhledných předmětů). Základem vnímání obrazu zrakem jsou rozdíly detailů, které se liší: a) velikostí b) tvarem c) jasem (kontrastem) d) chromatičnosti (barvou) e) hranovou ostrostí Při tvorbě obrazu objektivem by byl v ideálním případě zobrazován bod v předmětovém prostoru jako bod v obrazovém prostoru. Ve skutečnosti nezobrazujeme jednotlivé body, ale objekty složené z větších nebo menších detailů. Obrazy těchto detailů nejsou nikdy zcela dokonalé, jsou zatíženy souborem různě 12 5 velkých chyb, které způsobují jejich zkreslení. Obrazem bodu už není bod, ale (co nejmenší) ploška, jejíž velikost závisí na dokonalosti optické soustavy mikroskopu. Zvětšení ve světelném mikroskopu je omezené vlnovou délkou viditelného záření. Detaily, které se svojí velikostí dají srovnávat s vlnovou délkou světla, nelze vzájemně rozlišit. Tak zvané užitečné zvětšení končí, když dalším zvětšováním nedostaneme v obraze víc rozlišitelných detailů. Informační hodnota obrazu se za touto hranicí již nezvětšuje (vznikne prázdné zvětšení). Mikroskopy můžeme dělit podle toho, k jakému pozorování je mikroskop určen. Pozorujeme-li předměty v dopadajícím světle (vesměs neprůhledné předměty, minerály, materiál, drobné výrobky atd.), jde o pozorování při episkopickém osvětlení. Pozorujeme-li průhledné předměty v procházejícím světle, hovoříme o diaskopickém osvětlení. Tento způsob je nejčastější v biologii. Pozorování při diaskopickém osvětlení můžeme dále dělit na pozorování ve světlém a v tmavém poli. Světlé poleje více rozšířeno, jak již název připomíná, jsou pozorované předměty od světlého pozadí rozlišeny optickou hustotou nebo/a chromatičností. Při pozorování v tmavém poli jsou naopak pozorované předměty jasnější než pozadí. Důležitým případem pozorování ve světlém poli jsou metody, využívající fázový kontrast. Mikroskopie, využívající fluorescenčního záření, je zvláštním případem episkopického pozorování (epifluorescence - viz dále). Další rozhodující okolností je, zda pozorujeme tak, že objektiv je nad preparátem (vzpřímené mikroskopy), nebo zda se díváme na předměty „zespodu", pak je objektiv pod preparátem a jde o obrácený, invertovaný mikroskop. Optickou stavbou se tyto dva typy neliší, rozdíl je v mechanickém provedení. Vystačíme-li s „malým" zvětšením (přibližně 5x-350x) a klademe-li u obrazu důraz na prostorový vjem, pak používáme stereomikroskopy, o kterých budeme mluvit zvlášť. 6 Základní typy mikroskopů (Nikon) Následující obrázek ukazuje badatelský mikroskop Nikon ECLIPSE E 600 Je vybaven digitální kamerou DXM-1200, pnpojenou na trinokulárním tubusu pomocí adaptéru C-Mount, ve kterém je projekční okular (projektiv). V pravém okuláru tubusu je vložena destička s okulárovým měřítkem. Hranoly v trinokulárním tubusu dělí chod paprsků do okulárů nebo/a do výstupu pro kameru. Na stativu je osvětlovací nástavec s lampovou skříňkou pro episkopické osvětlení (osvětlení dopadajícím světlem). Mikroskop je vybaven pro polarizační měření, v optické ose je polarizační analyzátor a kondenzor s polarizátorem. Stolek je otočný se stupnicí v úhlové míře s noniem. Diaskopické osvětlení, vestavěné do stativu, je vybaveno kolektorem, filtry a polní clonou (Köhlerovo osvětlení), z pohledu je levý zaostřovací systém zakryt, vidíme jen jeho pravou část. digitální kamera DXM-1200 obvody kamery -^CCD-cip ér C-Mount projektiv i lí-^dapt o kul ary **>**__ o kul árové měřítko lampová skříňka (epi) otočný nosič objektivů (revolver) otočný stolek pro polarizaci kolektor žárovka lampová skříňka (dia) polní clona základna stativu zrcadlo ováni kolektor žárovka filtry Nikon ECLIPSE E600 NIKON ECLIPSE E 200 je vzpřímený rutinní mikroskop s episkopickým osvětlením (pozorování ve světlém poli) pro biologické laboratoře. Badatelský mikroskop NIKON ECLIPSE 80i s diaskopickým osvětlením v základní sestavě s trinokulárním tubusem a otočným kondenzorem Velký inverzní mikroskop NIKON ECLIPSE TE 2000 V částečném řezu je zakreslen chod paprsků a) do binokulárního tubusu b) do fotografického tělesa (čelní vstup) c) do CCD kamery (boční vstup vpravo) Rutinní inverzní mikroskop NIKON ECLIPSE TE 100 pro běžnou laboratorní práci. Stativ na obrázku nemá výstup pro připojení kamery, k tomu je určen typ TE 100 F s výstupem pro kameru 9 2 Základy geometrické optiky Fyzikálni základy světlené mikroskopie jsou součástí optiky. K popisu funkce čoček a celého mikroskopu stačí jednoduché rovnice, případně geometrické konstrukce. Čtenáři, který se zajímá hlouběji o fyzikální základy optiky doporučujeme, aby se vrátil k učebnici fyziky pro střední školy. Pro naše účely si zopakujeme významy některých pojmů, které budeme dále potřebovat k vysvětlení funkce mikroskopu. Základní optické prvky mikroskopu jsou objektiv a okular. Jsou to centrované optické soustavy, vrcholy jejich čoček leží na společné přímce, která se nazývá optická osa. Na optické ose mikroskopu leží středy všech jeho optických soustav, kromě již zmíněných jsou to: kondenzor, tubusová čočka, osvětlovací soustava a případně další doplňky. Pro zjednodušený výklad můžeme nahradit objektiv a okular mikroskopu tenkými spojnými čočkami. Středem (tenké) čočky, kolmo na její optickou osu, probíhá hlavní rovina čočky. Hlavní rovina H odděluje předmětový a obrazový prostor. Souměrná a tenká spojná čočka má jednu hlavní rovinu, „tlustá" spojná čočka nebo soustava čoček (objektiv) mají dvě hlavní roviny: jednu pro předmětový a druhou pro obrazový prostor, H', H. Podle vžité dohody je kladný směr paprsků z předmětového do obrazového prostoru. Veličiny předmětového prostoru označujeme apostrofem (např. F' = ohnisko předmětového prostoru). Vzdálenost předmětu, ležícího na optické ose nebo v její těsné blízkosti, od hlavní roviny předmětového prostoru je „předmětová vzdálenost" (v obrázku a). S ní přímo souvisí podobná veličina objektivu mikroskopu, tzv. „pracovní vzdálenost" (anglicky Working Distance, zkratka W.D.). Je to vzdálenost od povrchu krycího skla preparátu k čelní čočce objektivu. Užívá se též termín „pozorovací vzdálenost", je shodná s předmětovou vzdáleností. zobrazení spojnou čočkou F' ohnisko předmětového prostoru F ohnisko obrazového prostoru f ohnisková vzdálenost předmětového prostoru od hlavní roviny 10 f ohnisková vzdálenost obrazového prostom od hlavní roviny a předmětová vzdálenost b obrazová vzdálenost hi výška předmětu h2 výška obrazu H, H' hlavní roviny čočky S-i, S2 konjugované body Paprsky, které dopadají (z nekonečna) rovnoběžně na vstupní plochu čočky se na její hlavní rovině lámou tak, že dopadají do jednoho bodu na optické ose v obrazovém prostoru. Tomuto bodu říkáme ohnisko F (obrazového prostoru). Kolmice na optickou osou v tomto bodě je ohnisková rovina

n0 rychlost vlny klesne V'< Vo protože fo je konstantní *\ musí se zmenšit A', A' ystupuje objektu n0 prostředí s indexem lomu n0 vlna vystupuje do prostředí no, rychlost má opět v0, ale fáze se posunula, protože ve fázovém objektu se šířila nižší rychlostí *) poznámka: kdyby frekvence nezůstala konstantní, nastala by po průchodu objektem změna chromatičnosti (nebyl by to fázový objekt) Ze schématu vyplynulo, že po průchodu světla fázovým objektem získala světelná vlna fázové zpoždění. Tak se původně převážně koherentní světlo ze zdroje v mikroskopu rozdělilo na původní světlo zdroje (které jde mimo fázový objekt) a světlo, které po průchodu fázovým objektem získalo fázový posun. Protože rozdíl fází obou světel nezpůsobuje zřetelnou změnu amplitudy, je fázový preparát velmi nekontrastní a slabě viditelný. Pro další zpracování fázově modulovaného světla je důležitá ta jeho část, která má fázový posun 90° (n/2 rad. nebo A/4 vlnové délky). Takové světlo probíhá se zpožděním o A/4 za vlnami hlavního maxima nemodulovaného světla. Aby tento vlnový obraz získal pro náš zrak stejný význam jako při pozorování amplitudového preparátu, je nutné provést dvě opatření: 1) mezi světlem hlavního maxima a fázově modulovaným světlem musí být dosaženo dodatečného fázového posunu o A/4 (tj. 90°), takže celkový fázový posun je pak 180° (% A). Může proběhnout interference a výsledek je stejný jako při průchodu světla amplitudovým preparátem. 44 2) protože mezi jasem hlavního maxima a jasem fázově modulovaného světla je příliš velký rozdíl, musí být jas hlavního maxima ztlumen. Toho dosáhneme např. zařazením neutrálně šedého filtru do chodu paprsků hlavního maxima, zatímco modulované světlo zůstane netlumené. Technické prostředky, které způsobí změnu fázové modulace na amplitudovou, se vkládají do optické osy mikroskopu. Koherentní *} světlo z osvětlovacího systému je směrováno jeho kolektorovou čočkou do kondenzoru a zaostřeno na prstenec s mezikružím, který se vkládá do přední ohniskové roviny kondenzoru (tak vznikne „fázový kondenzor"). Světlo, procházející tímto prstencem osvětluje objekt (preparát) a projde jím buď částečně beze změny (hlavní maximum) nebo ve struktuře preparátu nastane modulace jeho fáze ohybem a následný fázový rozdíl. Obě světla dopadají do objektivu, v předmětové rovině objektivu je další „fázový" prstenec, na kterém se vytvoří konečný fázový rozdíl, potřebný pro amplitudový kontrast, pozorovaný v okuláru. Objektivy s fázovým prstencem se nazývají „fázové objektivy", pro pozorování amplitudových objektů ve světlém poli jsou jen omezeně použitelné (nastává v nich ztráta intenzity procházejícího světla). *) Koherentní vlnění má stejnou frekvenci, stejný směr kmitání a stejnou fázi (nebo stejný rozdíl fází) Tím byly splněny podmínky pro amplitudovou modulaci a pro vznik viditelného obrazu. Světlo, modulované strukturou fázového objektu má podstatně menší amplitudu než světlo hlavního maxima, takže pozorujeme tmavou strukturu objektu na světlém pozadí. Takto získaný obraz fázového objektu se nazývá pozitivní fázový kontrast. Na dalším obrázku je schématicky znázorněna úprava mikroskopu pro zviditelnění fázového posunu, fázově modulovaná vlna získá při průchodu preparátem celkový posun o 180° (tj. %A), takže obraz odpovídá podmínkám amplitudové modulace. 45 Je možné celý postup upravit tak, aby vznikl jasnější obraz struktury proti tmavém pozadí (podobně jako při pozorování v zástinu). Tomu pak říkáme negativní fázový kontrast. Používá se však zřídka, potřebuje jinak upravený kondenzor a objektiv. Na obrázku je fázový objekt, zobrazený mikroskopem s fázovým kontrastem při použití zeleného interferenčního filtru (GIF). Okraje kresby detailů mají pro fázový kontrast charakteristické halo, které ztěžuje přesnou specifikaci detailů. (Viz též fázový kontrast ADL, apodizovaný fázový kontrast). Na další stránce je obrázek výbavy k doplnění mikroskopu pro pozorování fázových objektů. Centrovací pomůcka se nasadí přechodně místo okuláru. Usnadňuje uložení kondenzoru s fázovými vložkami přesně do optické osy mikroskopu. To je podmínkou pro dobrý obraz fázového preparátu. Odklopná čočka je nutná při používání objektivů s malým zvětšením (< 4x). 46 Výbava mikroskopu pro fázový kontrast objektívy pro Objektiv pro fázový kontrast. Pro fázový kontrast nabízí Nikon řadu objektivů, které jsou označeny podle toho, k čemu je výrobce doporučuje: • DL (Dark Low = hluboce tmavý) - objektivy poskytují tmavý obraz na světle šedém pozadí. Tyto objektivy jsou určeny pro nejsilnější tmavý kontrast v objektech, které se vyznačují největšími rozdíly v indexu lomu. DL objektivy jsou nejužívanější při pozorování živých buněk a ostatního polopropustného živého biologického materiálu, jsou velmi vhodné pro mikrofotografii a digitální způsob zobrazování. • DLL (Dark Low Low = velmi hluboce tmavý) - objektivy jsou podobné typu DL, objektivy DLL jsou vhodnější pro světlé pole a jsou často používány jako „univerzální" objektivy v mikroskopech, využívajících více způsobů osvětlení jako např. fluorescence, DIC, světlé a/nebo tmavé pole. 47 • ADL (Apodized Dark Low = apodizovaný kontrast hluboce tmavý) tyto objektivy uvedl Nikon na trh v poslední době. Apodizovaný fázový kontrast používá na obou stranách fázového prstence sekundární prstence, ovlivňující optickou hustotu. Přidání sekundárních prstenců pomáhá při potlačování nežádoucího „halo" - efektu. Často se tyto objektivy uplatňují pro dosažení lepšího výsledku při mikrofotografii s fázovým kontrastem. • DM (Dark Medium = středně tmavý) DM objektivy poskytují tmavé obrysy objektů na středně šedém pozadí. Tyto objektivy jsou navrženy pro vysoký kontrast obrazu u objektů s malými hodnotami fázového posunu, jako jsou jemná vlákna, granule nebo částice. • BM (Bright Medium = středně jasný). Bývají často označovány jako objektivy pro negativní fázový kontrast. BM objektivy poskytují jasné obrysy objektu na středně šedém pozadí. Jsou ideální pro vizuální hodnocení bičíkovců, bakterií, malých globulí a pro počítání krevních buněk. Objektivy NIKON ADL lze použít u mikroskopů NIKON ECLIPSE s optikou CFI60. v současné době dodává NIKON pro tuto metodu objektivy CFI ACHROMAT ADL 10x, num. apertura 0,25, prac. vzdálenost 5,2mm, (Ph1) CFI ACHROMAT LWD ADL 20x F, n.a. 0,40, p.v. 3,0mm, (Ph1) CFI ACHROMAT LWD ADL 40x F, n.a. 0,55, p.v. 2,1 mm, (Ph1) CFI ACHROMAT LWD ADL 40x C, n.a. 0,55, p.v. 2,7-1,8mm, (Ph2) s korekcí na krycí sklo 0-2,Omm K objektivům ADL je nutné vložit do kondenzoru příslušné fázové prstence Ph1 nebo Ph2 Správná činnost mikroskopu s fázovým kontrastem závisí na přesném nastavení optických prvků, konkrétně na přesném umístění středu fázového prstence v kondenzoru do optické osy mikroskopu. K tomu je účelná pomůcka - centrovací dalekohled - který se nasadí do tubusu na místo jednoho z okulárů. Mikroskop může být vybaven Bertrandovou čočkou, která pak slouží ke stejnému účelu. Vkládá se obvykle otočným voličem v tubusu mikroskopu, pak není nutné vyjímat okular. Nepostradatelným doplňkem pro fázový kontrast je interferenční žlutozelený filtr (označuje se obvykle zkratkou GIF), který propouští je úzké pásmo spektra s vlnovou délkou kolem 560 nm. Na tuto chromatičnost je oko maximálně citlivé. Při nastavení mikroskopu s fázovým kontrastem postupujeme podle návodu, který je připojen k mikroskopu. Důležité je, aby bylo předem správně nastaveno "Kohlerovo osvětlení". Podstatou nastavení fázového kontrastuje umístění fázového prstence v kondenzoru tak, aby se kryl s prstencem v objektivu. Kondenzor se k tomuto účelu může nastavit do žádoucí polohy středícími šrouby v jeho objímce. Ke kontrole správného nastavení slouží centrovací dalekohled nebo Bertrandova čočka. Moderní mikroskopy jsou sestavovány z jednotlivých modulů, takže mikroskop lze vybavit pro fázový kontrast dodatečně. Určitou potíž může způsobit požadavek, aby 48 byl mikroskop vyzbrojen sadou objektivů pro světlé pole a sadou pro fázový kontrast, v tom případě je výhodné, má-li revolverový nosič objektivů 5 a více míst, případně může být tento nosič rovněž výměnný, což je běžné jen u velkých laboratorních a badatelských mikroskopů NIKON. Hoffmanův modulační kontrast (HMC) Rozšířenou metodou pro pozorování fázových objektů při zvýšeném kontrastu, používanou při fertilizaci in vitro (IVF), je Hoffmanův modulační kontrast. Tato metoda není založena na posunu fáze, ale na pozorování fázových objektů při šikmém osvětlení. HMC vyžaduje, aby do objektivu byl při výrobě vložen optický člen, kterému se říká modulátor a aby kondenzor byl vybaven štěrbinou. Pro zvýšení výsledného kontrastu je třeba na kondenzor nasadit otočný polarizační filtr. Chceme-li tedy využít HMC, musíme vybavit mikroskop speciálními objektivy s modulátorem a kondenzor upravit vložením štěrbiny, odpovídající tvarem zvolenému zvětšení v objektivu. Výsledný efekt spočívá v tom, že původní transparentní fázový objekt po nastavení HMC pozorujeme černobíle jako plastický, třírozměrný obraz. HMC mírně snižuje rozlišení, je však podstatně levnější, než diferenciální interferenční kontrast (DIC Normarski), který se používá k podobným účelům. Modulátor je skleněný disk, zpracovaný fotografickou cestou, na kterém jsou rovnoběžné proužky s rozdílnou optickou propustností. Úzký proužek (jen asi 5 % plochy disku) je tmavý, propouští jen 1 % světla, které na něj dopadne, o něco širší (asi 14 % plochy disku) tvoří proužek, propouštějící kolem 15 % dopadajícího světla a zbytek plochy disku je zcela propustný (má 100% propustnost). Modulátor je uložen v zadní ohniskové rovině objektivu. Objektivy, vybavené modulátorem, jsou označeny HMC. Objektiv HMC s modulátorem (Nikon) modulátor (zadní ohnisková rovina) pohled na modulátor v objektivu vnitrní deny objekt vu podložní sklíčko — preparát Pro úpravu objektivu vložením modulátoru se užívají objektivy CFI Achromát nebo CFI Pian Achromát (Nikon). Funkce modulátoru spočívá v tom, že pro průchodu štěrbinou v kondenzoru a fázovým objektem se některé paprsky vlivem optického gradientu fázového objektu 49 odklánějí a procházejí mimo transparentní sektor, o tom, kterým směrem se paprsky odkloní, rozhoduje rozdíl v indexu lomu částí objektu a jeho okolí, z původně průhledného fázového objektu tak vznikne černobílý obraz s obohaceným kontrastem, který vzbuzuje silný dojem třírozměrného (plastického) objektu. Hoffmanův modulační kontrast má ještě jednu výhodu: může být používán v případě, když preparát je v plastové Petriho misce (to bývá problém při použití DIC). Převážně se HMC užívá u invertovaných mikroskopů (Nikon TE2000 a podobně). fázový objekt při pozorování v HMC Objekt (Trichuris trichiura egg) vlevo pozorovaný s fázovým kontrastem, vpravo při použití HMC Polarizační mikroskopie Polarizační mikroskopie využívá vlastnosti světla, které říkáme polarizace. Tato mikroskopická technika má hlavní využití při pozorování neprůhledných objektů v mineralogii a geologii, avšak její aplikace najdeme přímo nebo nepřímo také v biologii, kde se užívají jako doplňky pro zvýšení kontrastu při pozorování v procházejícím světle. V kapitole o vlnových vlastnostech světla jsme se stručně zmínili o vzniku a vlastnostech polarizovaného světla, nyní si musíme některé pojmy s tohoto oboru vyložit podrobněji. Světlo jako příčné elektromagnetické vlnění kmitá (není-li nuceno chovat se jinak) ve všech rovinách, kolmých na směr paprsku, kterým se šíří. Tak se například chová bílé světlo z tepelného zdroje (svíčka, žárovka) při průchodu vzduchem. Obecně nezpůsobí změny v tomto chování světla látky, kterým říkáme izotropní. Tyto látky mají ve všech možných směrech stejné optické vlastnosti (např. propustnost, index lomu atd.). Typickými izotropními látkami jsou plyny, kapaliny, sklo (bez vnitřního pnutí), krystaly kubické soustavy atd. Lidský zrak nedovede rozlišit polarizované od nepolarizovaného světla. 50 U jiných látek se jejich optické vlastnosti se liší podle směru, kterým v nich světlo prochází. Tato látky se nazývají anizotropní. Prochází-li světelný paprsek anizotropní látkou, dochází u něho ke změně, které říkáme polarizace. Ze všech možných rovin, ve kterých světlo před průchodem anizotropní látkou kmitalo, převáží po průchodu jedna rovina, ostatní roviny jsou potlačeny. Takovému světlu říkáme lineárně polarizované světlo. Stupeň polarizace a směr roviny, ve které takové světlo kmitá, přinášejí často důležité informace o anizotropní látce, která tuto změnu způsobila. Další důležitou vlastností anizotropních látek je jejich schopnost rozdělit procházející paprsek na dvě části. Vznikne řádný paprsek (ve smyslu dodržování Snellova zákona o lomu) a mimořádný paprsek. Takovým látkám říkáme dvojlomné, jejich nejznámějším zástupcem je dvojlomný vápenec islandský. Lineární polarizace není jediným způsobem polarizace. Obecně rozeznáváme světlo a) nahodile polarizované b) lineárně polarizované c) elipticky polarizované Kruhově polarizované světlo je zvláštním případem elipticky polarizovaného světla. Kruhově polarizované světlo na příklad vznikne, sloučí-li se dva paprsky se stejnou vlnovou délkou s fázovým posunem A/4. Toho se dosáhne vložením fázové destičky (viz dále). Rozdíl mezi lineárně a kruhově polarizovaným světlem spočívá v tom, že směr vektoru intenzity světla se u kruhově polarizovaného světla otáčí kolem osy, proložené paprskem, zatímco u lineárně polarizovaného světla má směr konstantní. Chceme-li získat lineárně polarizované světlo, používáme obvykle polarizační filtry. Funkce polarizačního filtru spočívá v tom, že z „normálního" nepolarizovaného světla propustí jen ty paprsky, které kmitají v jedné rovině (kolmé na směr paprsku). Obrázek ukazuje funkci lineárně polarizujícího filtru 51 Polarizované světlo vznikne také při odrazu světelných paprsků od lesklých povrchů, jako jsou kovy, sklo, voda atd. Světlo oblohy je také částečně polarizované, jak se můžeme přesvědčit pozorováním přes polarizující filtr. V polarizačním mikroskopu používáme obvykle dva polarizační filtry. • první z nich, vložený do optické osy za polní čočku osvětlovací soustavu nazýváme polarizátor • druhý, obvykle před okuláry, se nazývá analyzátor Oba (nebo alespoň jeden z nich) lze otáčet kolem optické osy. Úhel, o který je otočíme, lze často odečíst na stupnici. Mezi tyto filtry vkládáme objekt, jehož polarizační vlastnosti nás zajímají. Polarizační filtry v mikroskopu mají dvě základní polohy. Jsou-li roviny, do kterých se v nich stáčí světlo při polarizaci, rovnoběžné, pak jimi světelný paprsek prochází jen s nepatrným omezením, které způsobuje jejich optická hustota. Jsou-li obě roviny na sebe kolmé, žádné světlo neprojde (vidíme tmu), z předchozího výkladu plyne, že otáčíme-li jedním z filtrů o 360°, pak vidíme v průběhu otáčení 2x největší jas a 2x tmu. Nastavíme-li polarizátor a analyzátor na největší jas, pak po vložení anizotropního objektu mezi tyto filtry nastane zeslabení obrazu a změní se jeho chromatičnost. Na tomto základu je založena polarizační mikroskopie. Pro správnou činnost polarizačního mikroskopu je podmínkou, že další optické členy mikroskopu (kondenzor, objektiv a okuláry) nesmí jevit vlastní polarizační aktivitu. Polarizační mikroskopy pro mineralogii a geologii bývají vybaveny otáčivým stolkem se stupnicí a s noniem, tedy s možností přesného odečtení úhlu otočení stolku s uloženým vzorkem. Jeden z okulárů bývá vybaven nitkovým křížem, aby bylo možné přesně určit, kde probíhá vzorkem optická osa mikroskopu. rekombinovaný paprsek Obrázek ukazuje uložení optických po Interferenci členů, které se účastní tvorby obrazu, v polarizačním mikroskopu. Rekombinovaný paprsek má po interferenci jiné vlastnosti, závislé na optických vlastnostech dvoj lomného objektu a na otočení analyzátoru. mimořádný paprsek lineárne polarizovaný -paprsek světlo__ ze zdroje - analyzátor rádný paprsek dvojlomný objekt — polerizártor 52 Dvoj lom světla Dvojlomné objekty jsou anizotropní a mají takové optické vlastnosti, že procházející světlo se v nich láme do dvou směrů a dochází přitom k polarizaci, v každém z obou paprsků kmitá světlo v navzájem kolmých rovinách. K dvojlomu může docházet různým způsobem, tři následující způsoby jsou významné pro polarizační mikroskopii: 1) V prvním případě jsou látky dvojlomné, protože mají určitou krystalickou strukturu. Tento jev nastává ve všech krystalických strukturách s výjimkou regulární soustavy (např. sůl kamenná). Hovoříme o vlastním dvojlomu. 2) Druhý případ dvojlomu nastává, působí-li na látky, které jinak nejeví dvojlom, určité síly (dvojlom způsobený napětím). 3) Třetí případ nastává, jde-li o soustavu částic, které jinak nejeví dvojlom, avšak je-li každá z nich alespoň v jednom směru výrazně menší, než je vlnová délka procházejícího světla. Podmínkou je, aby všechny částice byly stejně orientovány a byly v prostředí látky s odlišným indexem lomu. Zde se jedná o dvojlom, který je v polarizační mikroskopii biologických látek velmi důležitý -tzv. tvarový dvojlom. Tento druh dvojlomu může být překryt vlastním dvojlomem, vykazují-li stejně orientované částečky vlastní dvojlom. S tímto případem dvojlomu se v polarizační mikroskopii biologických objektů můžeme často setkat. Významným optickým prvkem jsou dvojlomné hranoly. Skládají se obvykle ze dvou klínů s dvojlomného islandského vápence, které mají zcela určitý tvar. Jsou navzájem slepeny průhledným kanadským balzámem, takže výsledná tvar je hranol. Nejznámější dvojlomný hranol se jmenuje po svém objeviteli Nicolův hranol, krátce Nicol. Nicolův hranol Obrázek znázorňuje dráhu paprsku, který se v něm dělí na dva - řádný a mimořádný. Při průchodu hranolem nastává lineární polarizace obou paprsků, jejich roviny polarizace se liší o 90°. 53 Průchod světla Nicolovým hranolem zdroj světla Oběma rovinám, ve kterých dvojlomný objekt propouští světelný paprsek, přísluší různé indexy lomu. Jeden z těchto indexů lomu odpovídá zákonu o lomu paprsků (Snellův zákon). Paprsek, který se láme podle tohoto vztahu, označujeme jako řádný paprsek. Index lomu, měřený ve směru druhé roviny kmitajícího paprsku, není v žádném vztahu k zákonu o lomu paprsků. Tento index lomu není stálý, ale mění se podle úhlu, pod kterým dopadá světlo na dvojlomné těleso. Na základě tohoto jevu, pro který neplatí zákon o lomu, vzniká druhý, tzv. mimořádný paprsek, jehož rovina kmitání je kolmá k rovině řádného paprsku. Podle toho jsou (většinou) indexy lomu pro řádný a mimořádný paprsek různé. Mikroskopické optice se používají modifikace Nikolova hranolu, které navrhl Wollaston a později Nomarski. Oba tyto hranoly jsou známé pod jménem svých objevitelů. Kompenzátory Z úvah v předchozích odstavcích můžeme u dvoj lomného objektu stanovit, který z jeho obou směrů kmitání (polarizovaného paprsku) přísluší většímu a který menšímu indexu lomu. Je pouze třeba vložit mezi zkřížené polarizační filtry do úhlopříčné polohy další, kladně dvojlomný pomocný objekt, jehož směr kmitání pro větší index lomu známe. Těmto pomocným objektům většinou říkáme kompenzátory. Analyzátor propustí světlo s největší amplitudou tehdy, jsou-li roviny kmitání v dvojlomném materiálu orientovány v úhlu 45° k rovině, ve které analyzátor propouští (polarizovaný) paprsek. Tato sestava se nazývá „úhlopříčná poloha". Anizotropní objekty se proto jeví střídavě tmavé a světlé, otáčíme-li jimi mezi dvěma polarizačními filtry (tj. v mikroskopu mezi polarizátorem a analyzátorem). Zkoumaný objekt vložíme do dráhy paprsků a otočíme jej do úhlopříčné polohy, kdy nastane největší propustnost světla. Směry kmitání mezi objektem s větším indexem lomu a kompemzátorem jsou vzájemně rovnoběžné, jestliže zkoumaný objekt způsobí vznik interferenční chromatičnosti vyššího řádu, než jaká vznikne průchodem pomocným objektem. Při vzniku interferenční barvy nižšího řádu leží oba směry kmitání k sobě navzájem kolmo. mimořádný paprsek 54 Interferenční chromatičnosti Pro polarizační mikroskopii a následně pro mikroskopii, využívající diferenciálního interferenčního kontrastu musíme popsat, jak se chová polarizované světlo v soustavě, která je složena z polarizátoru a analyzátoru, mezi které vložíme dvojlomný objekt. Nejprve se budeme zabývat případem, kdy použijeme monochromatického osvětlení, tedy světla s jedinou vlnovou délku. Po průchodu polarizátorem vznikne lineárně polarizované monochromatické světlo. To dopadne na dvojlomný objekt a v něm se rozdělí na dva paprsky, řádný a mimořádný. Oba paprsky projdou další polarizací v krystalu a kmitají nyní ve dvou, na sebe kolmých rovinách (což vede ke stejnému výsledku, jako kdyby byly kruhově polarizovány). Po průchodu analyzátorem bude mít paprsek amplitudu, závisející na rozdílu vlnových délek, na chromatičnosti obou paprsků a na tom, zda jsou průchozí směry analyzátoru a polarizátoru vzájemně rovnoběžné nebo na sebe kolmé. Kolmá vzájemná poloha je důležitá při zkoumání biologických objektů a říká sejí též „zkřížená poloha". Je-li rozdíl vlnových délek, který paprsek získal při průchodu dvojlomným objektem roven nule nebo celému násobku A, kmitá světlo ve stejné rovině, jako po průchodu polarizátorem. Protože je analyzátor ve zkřížené poloze, nepropustí žádné světlo a vidíme „tmu". Při vlnových rozdílech A/2, 3A/2 atd. vznikne rovněž lineárně polarizované světlo, které nyní kmitá v kolmé rovině k polarizátoru, takže analyzátorem prochází bez potlačení intenzity, v této poloze se objekt jeví jako maximálně propustný. Při rozdílech mezi nulou a A/2 vznikají různé odstíny jasu. Dostáváme tedy jiné výsledky, něž jaké nastanou při interferenci, vzniklé následkem ohybu paprsků (viz dříve). Prochází-li soustavou monochromatické světlo, pozorujeme za analyzátorem při plynulé změně rozdílu vlnových délek pravidelné střídání světlých a tmavých pruhů. Tmavé pruhy vznikají tehdy, způsobuje-li dvojlomný klín mezi polarizátorem a analyzátorem rozdíl vlnových délek, rovný celým násobkům A. Nápadné je, že použijeme-li modrého monochromatického světla, jsou tmavé proužky blíž, než použijeme-li světlo červené. Zřejmě je to důsledek vlnových délek, pro modrou je A přibližně 400 nm, pro červenou 700 nm. Použijeme nyní ve stejné soustavě bílé, nikoliv monochromatické světlo, které je plynulou směsí vlnových délek od 400 nm do 700 nm. Při všech polohách dvojlomného klínu, kdy byl při dopadu modrého světla výsledkem tmavý proužek, tento úkaz při použití bílého lineárně polarizovaného světla nenastane. Na jeho místě vznikne světelný proužek s chromatičnosti, smíšenou ze světla všech vlnových délek, které nebyly průchodem dvojlomným klínem potlačeny. Zvětšujeme-li tloušťku klínu, jsou ve výsledném spektru potlačovány vždy dlouhovlnější oblasti světla, takže vznikají další nové chromatičnosti. Dosáhne-li klín určité tloušťky, bude rozdíl vlnových délek 800 nm, tedy dvojnásobek vlnové délky modrého světla. Od této polohy klínu se při dalším zvětšování jeho tloušťky situace opakuje, vlnové délky odpovídají dvojnásobkům délek původních chromatičnosti, následujících ve spektru po modré. Opakující se sekvence mají klesající intenzitu chromatičnosti, říkáme jim „řády". Sled řádů chromatičnosti 55 znázorňuje tabulka, kterou sestavili Michel a Lévy. z rozdílů chromatičností lze odhadnout zpět rozdíl vlnových délek. Až k prvnímu vzniku červené mluvíme o spektru prvního řádu, při vzniku další červené druhého řádu atd. U řádů s vysokým pořadovým číslem už nepozorujeme žádné chromatičnosti, obdržíme opět „bílou vyššího řádu". Tabulka Interferenčních chromatičnosti (podle Michel-Lévy) dvojlom (rozdíl indexu lomu) n - n WO ÍDO 5Ů0 565 fOO 9Ů0 1130 1300 1500 16» 19M JIM JIH J500 JTflD ÍBÍ0 3H)0 V rozsahu červené prvního řádu způsobují malé změny v rozdílu průchodu zvlášť jasné změny barevného posunu. Tyto jevy můžeme využít pro zkoumání objektů s malým dvojlomem, jaký nastává často v biologických preparátech. K tomu se kompenzátor, který sám způsobí mezi zkříženými polarizačními filtry v úhlopříčné poloze vznik červené prvního řádu. Na místech v preparátu, která v tomto případě získají modrý barevný tón, leží směry s větším indexem lomu paralelně ke směrům pomocného objektu. Svírají-li směry úhel 90°, pak získají stejné struktury žlutou interferenční barvu. Představme si, že dvojlomný objekt, ležící v úhlopříčné poloze, způsobuje rozdíl v chodu (polarizovaného světla) o 550 nm, takže způsobí vznik červené interferenční barvy prvního řádu. Uložíme-li nyní nad tento objekt další, který vykazuje stejný rozdíl v chodu (paprsků polarizovaného světla), jako první objekt (tedy způsobí rovněž vznik červené prvního řádu) a natočíme-li jej tak, že leží vzhledem k prvnímu v adiční poloze, pak se rozdíl v chodu zdvojnásobí. Jako interferenční barva pak vznikne červená druhého řádu, jak to můžeme odečíst z barevné interferenční tabulky. Druhý objekt však můžeme otočit také do subtraktivní polohy. Rozdíl v chodu, způsobený prvním objektem, se nyní zmenší o rozdíl v chodu druhého objektu Protože jsou oba rozdíly stejné, je rozdíl v chodu - způsobený prvním objektem - působením druhého objektu zrušen, tedy kompenzován. Tak vzniká možnost pro měření rozdílu chodu paprsků, který vznikne v dvojlomnem objektu mezi řádným a mimořádným paprskem. Musíme k tomu jen vložit do dráhy 56 paprsků pomocné objekty (kompenzátory), které způsobují známý rozdíl. Jeví-li se pak zkoumaný dvojlomný objekt tmavý, jejím způsobený rozdíl v chodu stejný, jako u pomocného objektu. Aby však nebylo třeba pro každý možný rozdíl v chodu používat vlastní pomocný objekt, používají se pomocné objekty, které umožňují plynulou změnu rozdílu chodu. To je možné například tak, že pomocný objekt nakláníme, čímž se vlastně index lomu pro mimořádný paprsek a tím též rozdíl chodu paprsku mění. Polohu tohoto pomocného objektu měníme tak dlouho, až se zkoumaný objekt jeví jako tmavý. Na těchto pomocných objektech -kompenzátorech -je stupnice, na které pak příslušný rozdíl chodu paprsků přečteme. Nejpoužívanější je fázová destička, způsobující fázový posun jr-rad nebo 180° mezi řádným a mimořádným paprskem. Tato destička se označuje běžně jako A/2 kompenzátor. Destička A/2 obrací smysl otáčení kruhově polarizovaného světla a otáčí rovinu lineárně polarizovaného světla. Fázová destička s posunem A/4 způsobuje posun mezi řádným a mimořádným paprskem o 90° (tt/2 rad) a mění kruhově polarizované světlo na lineárně polarizované a naopak. Interferenční mikroskopie Diferenciální interferenční kontrast (Nomarski-DIC) Interferenční mikroskopie je kontrastovací metoda, která slouží - podobně jako mikroskopie s fázovým kontrastem - ke zvyšování kontrastu při pozorování průhledných fázových objektů. Její aplikace je rozsáhlejší a účinnější, než fázový kontrast, je však mnohem složitější a náročnější na technické vybavení mikroskopu. Základní princip interferenční mikroskopie znázorňuje obrázek: preparát dvojlonjný hranol zdroj světla Světlo, vycházející z osvětlovací soustavy mikroskopu, je rozděleno do dvou koherentních svazků paprsků. Po průchodu preparátem a objektivem se oba svazky opět spojí do jediného. Projdou-li paprsky preparátem (fázovým objektem) vznikne mezi oběma svazky rozdíl fáze, způsobený strukturou fázového objektu. Následkem toho nastane ve spojeném svazku interference světelných vln, která obecně způsobí 57 změny v amplitudě vlnění. Tak vzniknou kontrasty optické hustoty, což se projeví zviditelněním fázového objektu (který byl původně průhledný). Obrázek ukazuje Wollastonův hranol. Tečky a úsečky na světelných paprscích naznačují směr polarizace světla. Rozdvojení paprsků na dva svazky a jejich opětovné spojení se provádí vložením Wollastonových a v pozdější modifikaci Nomarského hranolů. Wollastonův hranol je složen ze dvou klínů dvojlomného islandského vápence v subtraktivní poloze, slepených kanadským balzámem.Jejich optická osa leží kolmo na směr dopadajícího světla, které před tím prošlo filtrem s lineárním polarizačním účinkem (polarizátor). Rovina tohoto polarizovaného světla svírá úhel 45° s rovinou, ve které světlo kmitá při průchodu hranolem, v prvním z obou klínů jsou paprsky rozděleny do dvou částí, které mají stejnou amplitudu. Nejsou sice ještě od sebe odděleny, ale v anizotropním prostředí krystalu se začnou lišit svojí rychlostí. Při vstupu do druhého krystalu se rozdělí na řádný a mimořádný paprsek. Řádný paprsek se po průchodu druhým krystalem změní na mimořádný, tím se pro něj sníží index lomu, takže se odkloní od kolmice (optické osy). Naopak mimořádný paprsek získá vlastnosti řádného paprsku a láme se ke kolmici. Nyní jsou oba paprsky od sebe odděleny, avšak úhel, který oba paprsky pro průchodu Wollastonovým hranolem svírají, je velmi malý. 58 Sestava mikroskopu s výbavou pro DIC: i , =i analyzátor optická Wollastonův (Nomarského) hranol 1 objektiv rovina preparátu kondenzor Wollastonův (Nomarského) hranol 2 ~j (lambda-destička) £ destička ' ' ( —i polarízátor Diferenciální interferenční kontrast s de Sénarmontovou úpravou Diferenciální interferenční kontrast navrhl a použil jako první Francis SMITH v r. 1955, který sestavil modifikovaný polarizační mikroskop, obsahující Wollastonovy hranoly v přední ohniskové rovině kondenzoru a v zadní ohniskové rovině objektivu. Výrobním problémem mikroskopů, užívajících Wollastonovy hranoly, byla podmínka, že objektivový hranol musel být součástí tělesa objektivu, neboť musel ležet v jeho zadní ohniskové rovině. Wollastonovy hranoly nahradil francouzský vědec Georges NOMARSKI modifikací, nazvanou jeho jménem. Nomarského hranoly mohou být umístěny v malé vzdálenosti od kondenzorové a objektivové apertury, takže je možno pro aplikaci systému DIC používat standardní mikroskopy, v dnešních mikroskopech, vybavených pro DIC, leží objektivový hranol v otočném nosiči objektivů a kondenzorový hranol v otočném nosiči kondenzorových modulů. Objektivy, používané pro DIC, nesmí způsobovat polarizaci (nesmí mít ve svých čočkách vnitřní pnutí). Obvykle se užívají společně pro polarizaci s označením DIC. V tradiční sestavě DIC systému je dosaženo potřebného fázového posunu vložením dvou hranolů Wollastonova nebo Nomarského typu do optické osy mikroskopu nastavených v takové poloze, že vznikne konstantní optický rozdíl (diference) dvou optických drah. Stejný výsledek může být dosažen použitím pevného systému Nomarského hranolů a jednoduchého de Sénarmontova kompenzátoru, který tvoří čtvrt-vlnová destička ve spojení s polarizátorem nebo analyzátorem. 47 59 Základní de Sénarmontova úprava D IC se skládá z polarizátoru a čtvrt-vlnové destičky ve společné jednotce ve výstupu z osvětlovací soustavy, jejíž nastavitelná poloha je zajištěna vrubovým šroubem. Zatímco nastavená poloha destičky je pevná, polarizátorem lze v optické ose otáčet v rozmezí 90° (plus nebo mínus 45°). S ohledem na polohu polarizátoru a v závislosti na poloze zpožďovací destičky prochází mikroskopem světlo s lineární, eliptickou nebo kruhovou polarizací. Vlnoplocha polarizovaného světla dopadne nejprve na pevný Nomarského hranol, uložený v otočném nosiči kondenzoru, kde se následně rozdělí na dva paprsky (řádný a mimořádný), jejichž směr (polarizovaného) vlnění svírá úhel 45° vzhledem ke směru vlnění světla, vycházejícího z de Sénarmonotova kompenzátoru. Optická soustava kondenzoru promítá rozdělené vlnění do dvou paralelních složek a promítá je do roviny preparátu. Světlo po průchodu preparátem projde objektivem do interferenční destičky druhého pevného Nomarského hranolu, umístěného nad objektivem v rámečku otočného nosiče objektivů. Objektivový Nomarského hranol, jehož poloha je sladěna s kondenzorovým hranolem (jsou obráceně orientovány), skládá zpět rozdvojené obrazové paprsky do souosého pravoúhlého systému. Ačkoliv je lineárně polarizované světlo, vycházející z objektivového Nomarského hranolu blokováno analyzátorem, elipticky a kruhově polarizované světlo touto složkou prochází a vytváří v okuláru obraz preparátu. Podobně jako při používání fázového kontrastu je metoda DIC užitečná pro zviditelnění živých buněk nebo jiných průhledných, nebarvených vzorků, které jsou při běžném použití světlého pole obtížně pozorovatelné. Metoda DIC není zatížena tvorbou nepříjemného jevu „halo", který provází klasický fázový kontrast a může být použita k pozorování relativně tlustých preparátů. Obrazy, získané metodou DIC, jsou velmi vhodné pro digitální snímací techniku, která umožňuje úpravy, vedoucí k dalšímu zvýšení kontrastu. Mikroskop NIKON Eclipse E600 s fluorescencí, CCD kamerou, s kruhovým stolkem a s de Sénarmontovou soupravou diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) analyzator_ objektivový Nomarského hranol kondenzorový Nomafůkéhi Ivano. ctvri-vlnova deslcka polarízátor 60 10 Fluorescenční mikroskopie Emise světelného záření, vzbuzená v látce světlem, teplem, chemickou reakcí nebo mechanickým namáháním, se nazývá luminiscence. Protože není provázena tepelným zářením, je známá též jako "studené světlo". Pokud je luminiscence vzbuzena světelným zářením, mluvíme o fotoluminiscenci, která se opět dělí na fluorescenci a fosforescenci. Zatím co fosforescence přetrvává po jistou dobu po excitaci světelným zářením, fluorescence trvá jen po dobu ozařování. Charakteristickým znakem fluorescence je, že fluoreskující látka (vesměs organického původu) absorbuje ultrafialové záření nebo záření z krátkovlnné části viditelného spektra a emituje záření o vlnových délkách větších, než má pohlcované záření. Důležité vlastnosti fluorescence: (v dalším textu: světlo = budící, excitační záření, fluorescence = vzbuzené, emitované záření) 1) Aby látka mohla vyzařovat fluorescenci, musí pohlcovat světlo. 2) Vlnová délka fluorescence je všeobecně delší, než vlnová délka pohlceného světla. Čím má fluorescence delší vlnovou délku, tím je slabší. Energie vyzařované fluorescence je vždy slabší, než je energie pohlceného světla. 3) Intenzita fluorescence je mnohem menší, než intenzita pohlceného světla. Pro koeficient útlumu k se udává řádová velikost 10"3 až 10~5 4) Intenzita fluorescence je úměrná intenzitě budícího světla (l0), hustotě vzorku C a koeficientu k. I a lo C K 5) Fluorescence se z látky vyzařuje do celého (kulového) prostoru, nezávisle na směru, ve kterém na ni dopadá excitační záření. 6) Fluorescence mnoha látek se vyznačuje postupným útlumem. 7) Fluorescence se pro každou látku vyznačuje charakteristickým spektrem vlnových délek. 8) Fluorescenční záření je vždy do určité míry polarizované. Ačkoliv je možné provádět fluorescenční mikroskopii v procházejícím světle (diafluorescence) i v dopadajícím světle (epifluorescence), budeme dále popisovat jen epifluorescenci. Diafluorescence se prakticky přestala užívat. (Poznámka pro lepší orientaci čtenáře v cizojazyčných textech dáváme přednost názvům, převzatým z cizích jazyků: např. bariérový filtr- česky závěrný filtr, excitace -česky buzení atd.). 5 5 61 Výbava mikroskopu pro epifluorescenci: Mikroskop musí být vybaven soupravou pro epifluorescenci, která obsahuje 1. zdroj záření, vyzařující světlo z krátkovlnného konce spektra (vysokotlakou rtuťovou nebo xenónovou výbojku v lampové skříňce) 2. excitační filtr (interferenční) 3. polopropustné dichroické zrcadlo 4. bariérový (závěrný) filtr Díly 2) až 4) jsou vloženy do tělesa ve tvaru kostky a tvoří tzv. fluorescenční filtr, který se vkládá do optické osy mikroskopu. Setkáme se také s názvy jako „filtrblok", blok fluorescenčního filtru apod. emisní {bariérový} flitr teleso (Wok) flHiu excitační (budící) filtr při ruba k upevnení filtru v telesu dichroické zrcadlo (délidchodu paprsků) Na fluorescenční filtry jsou kladeny následující požadavky: • mají propouštět směrem k pozorovanému vzorku záření pouze těch vlnových délek, které excitují nejintenzivnější fluorescenci. • pro pozorování nebo některý druh záznamu (fotografie, CCTV-kamera atd.) má být využita jen ta část emitovaného záření (fluorescence), která je po průchodu dichroickým zrcadlem a bariérovým filtrem nutná pro tvorbu fluorescenčního obrazu. Většina filtrů je selektivní (pro jedno vlnové pásmo excitačního a fluorescenčního záření), vyrábějí se však i dvou- a tří-pásmové filtry. Optické části mikroskopu (okuláry a objektivy) nesmí mít výraznou vlastní fluorescenci a nesmí podstatně pohlcovat fluorescenční záření. Pro běžné fluorescenční metody vystačíme s "normálními" objektivy, pro náročnou fluorescenci jsou určeny objektivy zvláštních vlastností (NIKON Pian Fluory, Pian Apochromaty). Kondenzor ve stativu mikroskopu nemá při epifluorescenci žádnou funkci, jeho činnost vykonává objektiv. Ä5 62 Mikroskop, vybavený epi-fluorescenčním zařízením Stručný popis epifluorescenční mikroskopie: Záření vysokotlaké rtuťové výbojky (ve směru kolmém na optickou osu mikroskopu) prochází excitačním filtrem, který propouští jen světlo o vlnových délkách, které jsou potřebné k excitaci fluorescence v pozorovaném vzorku. Pak je excitační světlo odráženo polopropustným dichroickým zrcadlem do směru optické osy mikroskopu přes objektiv (který zastává funkci kondenzoru) na pozorovaný vzorek, v tomto vzorku, připraveném pro fluorescenci specifickým barvením nebo vykazujícím vlastní fluorescenci, vzbudí excitační světlo fluorescenci. Fluorescenční záření ze vzorku dopadá zpět do objektivu mikroskopu. Dichroické zrcadlo nyní propustí ve směru optické osy mikroskopu směrem k okulárům jen záření delší vlnové délky, než mělo excitační záření. Bariérový filtr (nad dichroickým zrcadlem) pohltí zcela zbytek excitačního záření, které nebylo pohlceno vzorkem a které z malé části dichroickým zrcadlem prošlo, v okulárech mikroskopu (nebo v záznamovém zařízení) je nyní jen fluorescenční obraz. Příprava vzorku pro pozorování při fluorescenci: Některé organické látky jeví vlastní fluorescenci - např. chlorofyl, kyselina pikrová atd. Většinu vzorků pro pozorování při fluorescenci je však třeba připravit specifickým barvením. Barviva pro fluorescenci musí mít tu vlastnost, že po ozáření excitačním světlem jeví fluorescenci a musí specificky barvit jen tu část vzorku, která je pro pozorování důležitá. Taková barviva se nazývají fluorochrómy. Fluorescenční filtry se obvykle přiřazují k fluorochrómům, kombinace filtr-fluorochróm jsou uváděny v tabulkách. Metodiky pro přípravu vzorků barvením pomocí fluorochrómů jsou často velmi složité a vyžadují značné zkušenosti. 63 Obsáhlý popis fluorescenční mikroskopie najdete na webové stránce www.mikroskopy.cz v kapitole Články, návody pod názvem „Fluorescenční mikroskopie - teorie a praxe". Zde se jen stručně zmíníme o nových doplňcích, které uvedl v poslední době na trh Nikon. Zařízení k potlačení úrovně šumu (Noise Terminátor). Poměr signál/šum je významným ukazatelem kvality přenosové soustavy při přenosu informací. To platí i pro fluorescenční mikroskopii, ve které se informace o vlastnostech vzorku přenášejí optickou cestou. Je tedy žádoucí, aby tento poměr měl co největší číselnou hodnotu. Šum vzniká v mikroskopu rozptýleným světlem, ve fluorescenční mikroskopii z velké části světlem, které se odráží od vnitřních stěn tělesa fluorescenčního filtru. Terminátor šumu odvádí toto rozptýlené světlo z dráhy v optické ose mikroskopu do lapače paprsků v otočném tělese nosiče filtrů. Tím se významně sníží hladina šumu a fluorescenční obraz získá další kontrast. Zařízení je využito v šestinásobném otočném nosiči fluorescenčních filtrů (Eclipse 80i a 90i). Zařízení pro potlačení šumu Nikon Rozptýlené světlo pokračuje do lapače v otočném nosiči filtrů. sum optická osa mikroskopu Šestinásobný otočný nosič fluorescenčních filtrů (ochranný kryt nosiče je sejmut) (Eclipse 80i a 90i) 64 Zařízení pro vyrovnání excitace (Excitace Balancer) Nikon (Volitelný doplněk k fluorescenčnímu nástavci) V průběhu pozorování vícenásobně barvených fluorescenčních vzorků je pro pozorovatele výhodné, může-li snadno měnit vlnovou délku excitačního záření aniž by musel měnit fluorescenční filtr. Spektrální intenzita každé z vlnových délek excitačního záření při použití vícepásmového filtru se může plynule měnit nastavením polohy zařízení, které se nasunuje do optické dráhy exitačního záření. Vyrovnávač excitace (Excitation Balancer) volitelné příslušenství pro fluorescenční nástavec Eclipse 80i a 90i Nikon obsluha šoupátka vyrovnávače šo u patko vyrovnávače excitace zdůrazněná UV-excitace 65 Fluorescenční mikroskopie zaznamenala v posledních letech obrovský rozmach a její metody se užívají v mnoha odvětvích biologie i při zkoumání neprůhledných materiálů. Zejména se osvědčila v kombinaci s DIC a při aplikacích konfokální mikroskopie. V tomto přehledném materiálu nelze věnovat jednotlivým metodám fluorescence podrobnou pozornost. Zmíníme se jen velmi stručně o dvou fluorescenčních technikách, které fluorescenční mikroskopii zajistily popularitu. Imunofluorescence Je-li organismus napaden chorobou, kterou přežije, vytvoří se v těle protilátky. Ty pak brání organizmus proti novému napadení stejnou chorobou. Tomu se říká imunita. Látka, která je příčinou imunity, se nazývá protilátka, chorobu způsobuje antigen. Reakce mezi antigenem a protilátkou (antibody) je specifická. Poznávání průběhu reakce antigen/protilátka je podstatou imunologie. Imunofluorescence je metoda, používající fluorochrómů k označení protilátek. Fluorescence in Situ Hybridization (FISH) FISH je specifická metoda fluorescenční mikroskopie, používaná v genetice. FISH identifikuje (nebo "barví") cílové sekvence genomu tak, aby mohlo být studováno jejich umístění a jejich velikost. Sekvence DNA a RNA z vhodného, chromozómově-specifického vzorku jsou nejprve označeny "zpravodajskými" molekulami a později identifikovány fluorescenční mikroskopií. Označená DNA a RNA je pak hybridizována na sklíčku na metafázové chromozómy nebo na interfázové nuklidy. Po vyprání a zesílení signálu je vzorek vytříděn pro zpravodajské molekuly fluorescenční mikroskopií. Pomocí FISH je možné stanovit specifické základní sekvence chromozómů, buněk a tkáňových sekcí. Detekce hybridizovaného vzorku je umožněna pomocí fluorochrómu, který je zviditelněn fluorescenční mikroskopií. Lze rozlišit dva typy FISH: nepřímou a přímou metodu. U přímé metody je fluorochróm přímo vázán na vzorek. U nepřímé metody obsahuje vzorek látku (např. biotin) se specifickou afinitou k specifické látce, která je konjugována s fluorochrómem (např. avidin - FITC). První úspěšný postup FISH popsali RUDKIN a STOLLAR (1977), kteří vyvinuli nepřímou metodu, v dnešní době jsou mnohé postupy FISH komerčně dostupné. Úspěšná aplikace fluorescenční techniky pro metodu FISH znamená jeden z největších úspěchů moderní mikroskopie. TIRF - Total Internal Reflexe Fluorescence Fluorescence s úplným vnitřním odrazem Tento sofistikovaný postup při aplikaci fluorescenční mikroskopie slouží k excitaci a detekci fluorofórů v tenkých vrstvách vzorku. Je založen na potlačení fluorescence pozadí, kterou odklání mimo ohniskovou rovinu a tím podstatně zvyšuje poměr signál / šum a následně umožňuje prostorové rozlišení rovin ve vzorku, o které 66 máme zájem. TIRF využívá jedinečných vlastností indukovaných tlumených světelných vln v omezené vrstvě oblasti vzorku, přilehlé propojující vrstvě mezi dvěma prostředími, které se vyznačují rozdílným indexem lomu (na obrázku je to vodné prostředí a sklo), v praxi je nejčastějším používaným propojujícím prostředím kontakt mezi preparátem a krycím sklíčkem nebo kulturou v misce. Princip TIRF tlumené vlny fluorafúry vrstva propojení laserová excitace úhel i dopadu vodné prostredí fn = 1.33-1.37) excitovaný fluorc-fór _ podložní sklitto (n = 1.518) odražené svetlo Princip TIRF není nový a byl již dříve středem zájmu, avšak teprve pokrok v mikroskopické technice umožnil jeho praktické využití. Přispěl k tomu také vývoj v technologii fluorofórů a nové metody v genetice. Teoretické základy TIRF jsou natolik složité, že by jejich popis neúměrně zatížil rozsah této příručky. Zájemce odkazujeme na webovou stránku http://www.microscopyu.com, kde najdou odpovědi na další své otázky.