IKCIONACE BUNĚK / SEPAR
YTICKÉ TECHNIKY / PROTEIN
NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LÁT
ira
♦ HOMOGENIZACE TKANÍ. BUNĚK. CENTRIFUGACNI TECHNIKY
♦ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE, SEPARACE A ANALYTICKÁ STANOVENÍ, MALDI TOF
LYNOVA CHROMATOGR
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=

® fořbin
b L-něk
n£n
V/
(5) protlačeni bunek m*ryrn otvor* m
®
poulrli mirnehú d«terg*nlu na perforaci platmatjclté mann briny
(*) roibiti bun*k dobro téínrcnn rutaínim uisiem v M u störten no

^
O
o
CT

.Pí
%■■
CENTRIFUGACE
úhlový rotor
p*ft£*rQv4 fcorrKjrj
PQkutrty IťiMvriál
motor
/ ULTRACENTRIFUGACE
výkyvný roť
výkyvný rrtor
írfltlírifi»» l<l*
BuNECr.i	**-*
hOmogemat-----	SS
ďtd evwiruQio	::%V
	:'..-■
	|     I    T
	í$
CÉNfftlrUGACE
PAED
*ŮV(WÍ poufd
- gbl*fiU|K> mfflii
Htr*iPo>ky
SEGMENT
■ tříti ilwíiy
PO
rního lékařství v Brně
Ii9nl\/Ťr=
DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE:
I / O KliEl^nflHmTI
iZTŤM
#■
nirleaobrAtkowi centr Hug»ůu

bunůCny
homoganát
J -,SUPERNATANT 1

aTf*drt*obritkova «řnlrifugace
í
SEDKWIENT 1
celé buňky.
rádia. c:yroskelel
Ví m-
nSUFEBNATANTB
vysoko o b ritkou
Ľi!rilriŕL.gj>rfl
SEDIMENT 2
l*Tosomy. peFostlsomy
^ ■ ■   i       i."
j. ~ -j
SuPtfiNATAftiT 3
u-1 Ir« c« nt ri íu g ace
\ SEOÍMENT3 flfi Hr&Hjm y,
další maíŕ vÉtky
SEDIMENT 4
ľibOBOFIW.
wlfce mak.ľôni&l<rfculy
CENTRIFUGACE V SACHAROZOVEM GRADIENTU
immmvTSíFf
EhbE
non*          CENTRíFuGACť

W
W
»»oiiľiintiijici Uůíkj*
rychto t*d<rrMntuJK< ttotkM
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
Detector
Detector Oven
Detector Electronics
i
Potentiometrie Recorder or Computer Data Acquisition and Processsing System
Sampling System
Column
Column Oven
Oven Controller
' stacionárních a mobilních f
♦ REVERSNÍ faz
nepolární stacionární fáze (C18, C8, fenyl) vs. mobilní fáze se snižující se polaritou (voda/metanol, voda/acetonitril/THF)
♦  NORMÁLNÍ FÁZE / IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE
polární stacionární fáze (amino-, OH-) vs. mobilr fáze se zvyšující se polaritou
♦ GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
pecifické zakončení stacionární fáze (protilátka, SH- apod.), rozdělení na základě specifických interakcí
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
LC:t
♦  FOTOMETRICKÝ (změna absorpce, jedna vln. délka nebo diode array detektor  _» spektrum analytu)
♦  FLUORIMETRICKY (změna fluorescence, jednc excitační a jedna emisní vln. délka nebo diode arraw*
RADIOMETRICKÝ (sloučeniny značené 3H, 13C,32
♦ HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR (stanovení m/
♦ další detektor
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
Uspořádání spektrofotometrického
LL
5nra7s3íT»I«r5E33ffi
zdroj světelného paprsku
absorpce světla
emise fluorescence
iviALui lur-ivi^ (matrix Associated Laser uesorpiion
Ionization Time of Flight Mass Spectr------
základní uspoř
D SJ]
^m
Optics
Sample       \ Probe           V
Trigger
Ultraviolet L:
.■» a a »»
Data Analysis
Oscilloscope
Detector
Drift ^ Region      T (
7tttVh
r
Deflection Plates
I          Amplifier
Vacuum
Voltage Potential
konverze dat:     TOF spektrum (t = (m/z)
hmotnostní spektrum
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorpti
\ü
[Till
vz
or au
Pulsed Laser Beam N, -337 nm
t        T°
fc    TOF MS
Sample
(matrix + anal]
Sample Holder
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
Gelová filtrace (g
ermeacni chromatografie
lúk rojpoUÉtédl*
1      I      !
• *•
pOtétr\i HT*k&
.
malt maMuty vůřnornxhůfn.-k-.
V*Jkí mo^kuly
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
nizKoiiaKa i_
: separace DiiKovin a nizKomoieKuiarnicr
látek (nukleotidy, metabolity, xenobiotika)
ruípouitfrďlo plyrliit« pľn1flki*MCi n »n*s*nv     *IOupt**Ti t vfel k« r-ifj.
I
-
:
tuhi
■l.Tf'ľ-
v
v v
/
půiííni
látka
í^umavta^^
ô ú
w
L^
CT.
Gelová filtrace: separace standardních bílkovin /
spektrofotometricka detekce
Gelová filtrace s radiometrickou detek specifickou pro značený substrát a metabolity
fwlK
I
to* rozpauliédlj
i
i
-■ • •		• * * * # 1	•• * *	
		ft        *	+        i	r
■ ladné
npbllY
njivaiana
oporné
molfrkutl
vůl n J
n*tnci mct*kuli
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
lonexová HPLC: rozdělení protein zvyšující se iontovou
tu míti tiíl
.'   Mha
-..:*.rr*  I-J,
Afinitní chromatografie
lok rcupcutoidl*
I   1   I
i

♦
^5 %
a
/ \
Jrnto
nftrAJAnvffi
rtJVánna
mpltfcul«
wr>iyer\u
dfllil průCn-ny VHjtn^pio1c-k*|.
♦ Koncentrace steroidního hormonu, stanovení aktivity CYP3A isoenzymů (6beta-OH-T), CYP19 (T - E2)
♦ Koncentrace mastných kyselin, stanovení aktivity PLA, COX
E9L
Stanoveni cizorodých látek, které se obtížně zplyňují nebojsou termolabilní (vysokomolekulárni PAHs)
♦ Preparativní HPLC (izolace nukleotidů, metabolitů, peptidů, protilátek atd.)
♦ MALDI-TOF (LC-MS velkých mole,'■■, fragmentovaných bílkovin)
Reversní HPLC analýza PAHs: detekce pomoci diode-array detektoru (DAD)
0.11
D-10
í. 02
0.01
chfüffiiilüci
záznamL
vybraný
vlnový«
TTöü    »hbo" is;<to   Soloo' ü5Löo" "íqIGO   ísloo'   «koí   «:«    so.co    ssioo   eo.oo   ss.oa   lo.oo

Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor, detekce)
														
	90,00-			\										
	60.00									AA				
	70.00-									1				
	GO. 00,												1	
1	90.00			1										
	to. Ů0-			'										
	30.00													
	30.00-											i		
	10.00-									/li		V		
	0.00-									_^7     v				
	20	.00	a*Loo       lo.oc		3i:oo	iaiob ■	33:00       s*:ob	35.00	ie.oô	37; 00          36.0C		3$: 00		
							Minutes							
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorpti zation Time of Fliaht Mass Soectro
lad st
on.

Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
UŽITI LC PRO FRAKCIONACI VZORKU   PŘIKLAD STANOVENI
GANICKÝCH CIZORO
SAMPLING EXTRACTION
Silica gel fractionation
hexane
DCM/ hexane
DCM
methanol
ALIPHATIC FRACTION
NEUTRAL
AROMATIC
FRACTION
Aminopropyl silica column
SEMIPOLAR FRACTION
NPAHs, oxy-PAHs
POLAR FRACTION
carboxy-, aldehydes etc.
HPLC, G<
PAHs<252
PAHs>252
PLC
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
Uspořádání plynového chromatografu (GC)
ECD (chlor, látky) MS (rozdělení podle hmotností fragmentů)
Gas Supply Unit
Flow Controller
Flow Programmer
I
Sampling Unit
Injector
(Manual or Automatic)
Injector Oven
Column Unit		
Column		
	Column Oven	
		
	"		
Detector Uiut			
	Detector		
			
I	ietector Oven		-^
			^
Micioprocess&!' for flow Controller and Programmer
Injector and Injector Oven Controller
Column Oven Controller and Programmer
Detector Electronics and Computer Data
Acquisition and Processing System
Detector Oven Controller
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
GC: Přechod látek mezi stacionární a mobilní fází
Direction of Flow
Mobile Phase
Solute Transferring From the Stationary Phase to the Mobile Phase at the Back of the Peak Profile
Profile of Solute Concentration in the Stationary Phase
Stationary Phase
Profile of Solute Concentration in the Mobile Phase
Solute Transferring from
the Mobile Phase to the
Stationary Phase at the
Front of the Peak Profile
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
GC/ECD (electron capture detector): princip dete
anoda
Ni63
Ni63
— CI + e
— CI
vychytávání elektronů chlorovanými látkami, snížení el. proudu
PW   VB   v -zaric
nosný plyn + analyty
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
GC/MS:
analýza PAHs (SIM - fragmenty M+
MW202
MW228
MW252
MW242
C hrom a to g ram  Plots
Plot 1 Plot 2 Plot 3 Plot 4 Plot 5
\saze_2_25.10.2004_2 \i \saze_2_25.10.2004_2 \i \saze_2_25.10.2004_2 \i \saze_2_25.10.2004_2 \i \saze_2_25.10.2004_2 \i
I z 300_ric.sm s   R IC  all Iz300_202.sms   Ion: 202 all Iz300_228.sms   Ion: 228 all Iz300_252.sms   Ion: 252 all I z 300   242.srn s   Ion: 242 all
M Count:;

M Co un4i;
kC ounts 500-
400-300-200-1 00-
1 25-
1 00-
75—
50-
25—
kC ounts 30-^
WVWULllAiKi
u
RIC  allsaze_2_25.10.2004_2 ulz 300_ric.sms
^ &
jW^_JLJI
-^k--------,Jf£
lon:202 allsaze_2_2 5.10.200 4_2  ul z3fr)_202.s
lon:228 allsaze_2_2 5.10.200 4_2  ul z30=)_228.s
lon:252 allsaze_2_2 5.10.200 4_2  ul z30=)_252.s
lon:242 allsaze_2_2 5.10.200 4_2  ul z3tF)_242.s
STAN
ATICK OVA KINETIK
AIWXMA
♦ E +
Stanoveni produktu:
koncentrace produktu / čas . prot. = pmol produktu / min. (mg prot./ml)
♦ Příklady stanovení:
- fluorimetricke stanovení produkce resorufinu (EROD, MROD, PROD, BROD);
- HPLC stanoveni metabolitu mastných kyselin, např. 5-OH-FA (5-LOX);
- chemiluminiscenční stanovení luciferazy
v
i Si
Ö
Ö
[S] / (K + [S])
MtJl
5*.M
SUBSTRÁTY ENZ
s pektrofluori metrická detekce produktu enzymové reakce -silně flureskujícího resorufinu (exc. 530-570, em. 585 nm)
Alkylresorufins (alkoxyphenoxazones)
Enzymová kinetika: dvojitě reciproké vynesení (Lineweaver - Burke: 1/v0 = (KM/V)(1/[S]) + 1/V